最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2 Protocal 1.G418的配制: 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。 2.细胞培养:取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。 3.制备筛选培养基:在100ug/ml,1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。 4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。 5.换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。 6.确定最佳筛选浓度:在筛选10,14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况:用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度～心得:由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞 ，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进行筛选。 通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。 a 转染:转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1:4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50,,70,汇合时; b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。 c 换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。 筛选10,14天后，可 见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后; d 挑单克隆:制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。 e 单克隆鉴定:细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。 常见问题: 1.转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的, 无怪乎两种形式:整合在染色体中和存在于细胞质中。没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。 2.neo基因和目的基因是不是一定会整合在一起, 整合是随机发生的非同源性重组，neo基因表达而目的基因不一定都表达，所以在筛选之后还要用RT-PCR的方法进一步鉴定。 培养基处理的个人技巧 体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程，期间细胞对培养液具有同化作用，即细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。这个过程也是细胞同化培养基的过程。细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数目多比数目少较易生长。在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利于生长。我是用适应性培养基来解决这一问题的: 适应性培养基的配制 a 培养同源细胞至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24,48小时后，吸出所有培养液 b 离心:3000,4000rpm 10 min后，吸取上清液 c 虑过:再经直径0.22um滤器过滤，再加入2倍体积的新鲜培养基，低温冻存备用。 eeflying 1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/mL，每孔100uL加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ng/mL等12个级别。培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 ,. 我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。 ,. 即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。 转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。 操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留200cell左右就可以进行该操作了， 该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 中均有讲述。 1. 可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。 2. 那为什么还要筛选基因,是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓100个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个， 这些球均为红球的概率有多大呢,应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢,用刚才的例子来说，如果我们抓着5个红球，另一次抓着10个红球，可以肯定，第二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。 3. 维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。 4. neo的产物是酶，过高的G418浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。 5. 胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。 仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。 在第10天左右就手挑单克隆或者96孔板单克隆操作了 本帖开始我就讲了如何确定基准浓度，筛选浓度是基准浓度的高一级，维持用筛选浓度的一半。