【实验目的】
掌握凝胶过滤层析的原理及操作方法
【实验原理】
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质,多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质,小分子物质能进入其内部,流下时路程较长,而大分子物质却被排除在外部,下来的路程短,当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时,溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
1、器材:核酸蛋白
检测
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仪、层析柱、水浴锅、真空泵
2、试剂:SephadexG-25
【实验步骤】
(1)凝胶的选择:在经过膜分离后,分子量<5000。本次实验选用G-25葡聚糖凝胶(分离范围1000-5000)。
(2)柱子的选择:分子量<5000,膜分离后玉米肽中不同的小肽分子量比较接近,属于分级分离,所以选用50*1.6规格的柱子。
(3)干凝胶用量的计算:柱子体积/膨胀度,G-25膨胀度是4~6。
(4)凝胶的预处理:
将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。可以用玻璃棒搅拌,但是不能剧烈,防止凝胶破裂。多洗几次,尽量洗干净。自然溶胀费时较长,加热可使溶胀加速,即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸,1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。充分溶胀后,进行真空脱气。
(5)洗脱液的选择:本实验采用蒸馏水做洗脱液。
(6)凝胶的填充:将层析柱与地面垂直固定在架子上,然后将处理好的凝胶倒入柱子里,不能有气泡,要防止干柱。
(7)柱平衡:装柱完成后,用洗脱液来平衡柱子,直至核酸蛋白检测系统基线保持水平半个小时以上。
(8)上样:上样量在5%~10%。
(9)
标准
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曲线的制作:
本次实验用到还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、杆菌肽(氧化型谷胱甘肽(GSSG), M=612.63;还原型谷胱甘肽(GSH),M=307.33;杆菌肽M=1422.69)。三种肽各称取0.03g 配成2ml,进行层析,在恒定流速下进行凝胶过滤层析。得到理想的出峰情况后,根据出峰时间与分子量大小作出标准曲线,得到曲线方程。
(10)样品分子量的确定:
在与标准品层析的相同条件下上样,对样品进行凝胶过滤层析。从层析图上得到出峰时间,然后根据标准曲线方程便可以计算得到对应的分子质量。
浙公网安备 33021202002483