货号:MS1202 规格:100管/96样谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒说明书
微量法
注意:正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-Px 不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应,生成氧化型谷胱甘肽GSSG,从而保护生物膜免受ROS的损害,维持细胞的正常功能;而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。
测定原理:
GSH-Px催化H
2O
2
氧化GSH,产生GSSG;谷胱甘肽还原酶(GR)催化NADPH还原GSSG,再生GSH,
同时NADPH氧化生成NADP+;NADPH在340nm有特征吸收峰,而NADP+没有;通过测定340nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。
自备仪器和用品:
低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸馏水。
试剂组成和配置:
试剂一:液体×1 瓶,室温保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。
试剂三:液体×1 支,-20℃保存。
混合试剂配制:临用前,在试剂二中加入试剂一 20mL,充分震荡溶解后加入全部试剂三,混匀。(当天用完)
试剂四:液体×1 瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加
入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500
万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间 3min);
然后 8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接测定。
GSH-Px 测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到340nm,蒸馏水调零。
2. 混合试剂在25℃或者37℃(哺乳动物)水浴中预热30min。
3. 空白管:依次在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL蒸馏水、160μL预热的混合试剂,20
μL试剂四,迅速混匀后于340nm 处测定第10s和第190s的吸光值,分别记为A空1和A空2。
△A空白管= A空1﹣A空2。
4. 测定管:依次在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL上清液、160μL预热的混合试剂,
20μL试剂四,迅速混匀后于340nm处测定第10s和第190s的吸光值,分别记为A测1和A测2。
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△A 测定管=A测1﹣A测2。
GSH-Px 活性计算:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
GSH-Px活力单位定义:一定温度中,每mg蛋白每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V 反总×109]÷(Cpr×V
样)÷T=536×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr
(2). 按样本质量计算
GSH-Px 活力单位定义:一定温度中,每g样本每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/g)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×109]÷(W×V 样÷V
样总)÷T=536×(△A 测定管-△A 空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:一定温度中,每104个细胞每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/104cell)= [(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×109]÷(细胞数量
×V样÷V样总)÷T=536×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞数量(4)按液体体积计算
活性单位定义:一定温度中,每毫升液体每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/mL)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×109]÷V 样÷T
=536×(△A 测定管-△A 空白管)
ε:NADPH 摩尔消光系数 6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1 cm;V 反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4 L;106:1 mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);W :样品质量;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL =2×10-2mL;V 样总:提取液体积,1mL; T:反应时间,3 min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
GSH-Px活力单位定义:一定温度中,每mg蛋白每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×109]÷(Cpr
×V 样)÷T=1072×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr (2). 按样本质量计算
GSH-Px活力单位定义:一定温度中,每g样本每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/g)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×109]÷(W×V 样÷V
样总)÷T=1072×(△A 测定管-△A 空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:一定温度中,每104个细胞每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/104cell)= [(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×109]÷(细胞数量
×V样÷V样总)÷T=1072×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞数量(4)按液体体积计算
活性单位定义:一定温度中,每毫升液体每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/mL)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×109]÷V 样÷T
=1072×(△A 测定管-△A 空白管)
ε:NADPH 摩尔消光系数 6.22×103 L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5 cm;V 反总:反应体系
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总体积,200μL=2×10 -4L;106:1 mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);W :样品质量;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL =2×10-2mL;V 样总:提取液体积,1mL; T:反应时间,3min。
注意事项:
(1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;
(2)混合试剂和底物液须临用前配制,配完后置于冰上,当天使用完;
(3)测定过程操作须迅速;
(4)细胞中GSH-Px活性测定时,细胞数目须在300万-500万之间,细胞中GSH-Px的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。
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