农杆菌介导法的植物遗传转化_cropped

农杆菌介导法的植物遗传转化_cropped 生 化 研究 重庆三峡学院学报——JOURNAL OF CHONGQING THREE GORGES UNIVERSITY 2006 年第 3 期 第 22 卷——No.3. 2006 Vol.22. 农杆菌介导法的植物遗传转化 陈再刚刘仁华胡廷章 ,重庆三峡学院,重庆 404000 , 摘 要,农杆菌介导的基因转化是一种使外源 DNA 转移到目的植株的天然系统,通过植物表 达载体上 DNA 的加工与转移将外源 DNA 转运到植物细胞中。因其具有易操作、低费用、高效率、 插入片段确定性好和转基因拷贝数低等独特优点,已经成为转基因策略中的首选方法,在植物的 遗传转化中得到广泛应用。 关键词,农杆菌,植物,遗传转化 中图分类号,文献标识码,A文章编号:1009-8135(2006)03-0081-02 Q943 自 1983 年第一株转基因烟草问世以来，植物的遗传转化已取得了令人瞩目的成就。在众多的植物转基 因方法中，农杆菌介导法和基因枪法的应用最为广泛。特别是农杆菌介导法，因其具有易操作、低费用、 高效率、插入片段确定性好和转基因拷贝数低等独特优点，已经成为转基因策略中的首选方法。 1 农杆菌介导法植物遗传转化的机制 1.1 农杆菌的 Ti 质粒和 Ri 质粒 与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型:即根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)。根癌农杆菌含有 Ti 质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤。发根 农杆菌含有 Ri 质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。根癌农杆菌的 Ti 质粒和发根农杆菌 Ri 质粒都具 有一段转移 DNA (transfer DNA，又称 T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携 带的基因在植物中得以表达。由于 T-DNA 能够进行高频率的转移，而且 Ti 质粒和 Ri 质粒上可插入大到甚至 150 [1-6]kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和 Ri 质粒已成为植物基因转化中的理想载体系统。 1.2 与农杆菌转化相关的基因 与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和 Ti 质粒上 T-DNA 以外 Vir 区的基因。染色体基 因包括 chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及 chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细 胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD 蛋白可能在低 pH 和磷酸饥饿情况下提高 VirG 蛋白 的合成水平。ChvE 与 VirA 蛋白共同对 virG 起激活作用。Ti 质粒的 vir 区大小为 30 kb，分 virA、virB、virC、 [2] virD、virE、virG、virH 等 7 个操纵子，有 24 个基因共同控制着 T-DNA 的加工和转移，总称为调控子。 1.3 Vir 基因的诱导表达机制 在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物，如乙酰丁香酮(acetosyringone， As)。当农杆菌接受到此类信号时，其 vir 区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一 些特异单糖，As 和单糖可协同诱导 Ti 质粒上 vir 区基因的表达。 Vir 区基因的活化首先是从 virA 基因开始的。VirA 蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白，可直接对 植物产生的酚类化合物感应，其感应部位可能位于胞质区域。VirA 蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身 收稿日期:2006-01-12 作者简介:陈再刚,1966-,,男,重庆万州人,重庆三峡学院讲师。 基金项目:重庆市教育委员会应用基础研究资助项目,KJ061108,,重庆三峡学院资助项 目。-81- [4] 被磷酸化激活后，使 VirG 蛋白活化。VirG 蛋白是 转化效率高。其次，农杆菌转化的过程中，所整 DNA 结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到 合的外源基因结构完整、变异较小，且整合位点稳 vir 启动子的特定区域，从而成为其它 vir 基因转录 定，一旦插入几乎不再移动，且拷贝数也较少，大 [5-6]的激活因子，打开 VirB、virC、virD、virE、virH 等 另外，农杆菌转化方法使多只有 1,3 个拷贝。 几个基因。ChvE 可大大增强 vir 基因被 As 诱导的 用的技术设备较为简单。 效果，ChvE 可结合一些单糖，也可直接与 VirA 周 农杆菌介导的基因转化也存在着一些缺点，如在 [2,3] 质区相互作用，以加强 As 对 Vir 基因的诱导。 农杆菌转化过程中会对植物材料造成一些损伤， 1.4 T-DNA 复合物的形成T-DNA 转化有时引起左边界的丢失，可能会以串联的 [7-9] T-DNA 的加工与转移是由 Vir 基因被诱导后产生 方式整合在染色体上，转化宿主存在局限性等。 3 农杆菌介导法植物遗传转化的应用 的蛋白完成。VirD 基因编码的两个产物VirD1 和VirD2 直接参与加工过程。VirD1 蛋白是一种拓扑异构酶， 农杆菌对植物细胞的转化需要两方面的先决 可将超螺旋型 DNA 变成松弛型 DNA。VirD2 蛋白具 条件:一是植物受损细胞必须分泌足够浓度的诱导 有特异剪切单链 DNA 的内切酶活性，它可以识别 物;二是细胞正在进行活跃的 DNA 合成或正处于 [1] T-DNA 底链边界重复序列上的特定位点，并在底链 旺盛的细胞分裂状态。双子叶植物作为农杆菌的 24 bp 重复序列和第四个碱基之间切割，将 T-DNA 从 天然寄主，在农杆菌介导的基因转化中早已取得成 Ti 质粒上剪切下来，称为 T-strand 或 T-链。切开 T-DNA 功。裸子植物虽然也是农杆菌的天然寄主，在挪威，[10] 后，VirD2 蛋白与 T-链的 5端共价结合，避免核酸外 云杉、松树等其他裸子植物中也取得成功，但是 切酶降解 T-链。新的 T-DNA 底链以此链为模板，从 长期以来由于受到外植体培养、转化和选择频率等 右端产生的 DNA 缺口处以 5’-3’方向进行合成。被取 的影响，农杆菌介导裸子植物的转化一直受到限制 代的旧链游离出来，与许多 VirE2 蛋白分子结合组成 早期研究中认为，单子叶植物特别是草本植物可 T-DNA 复合体。此外，VirD2 作为一个导向蛋白，可 能不产生酚类物质，或者产生的量极微，不足以诱导 以指导整个 T-DNA 复合体(或叫 T-复合体)从农杆 农杆菌的 T-DNA 的转化。但对水稻信号分子的分离 [2,3] 菌进入到植物细胞核。 和鉴定研究结果表明:单子叶植物确实含有高效诱导 1.5 T-DNA 复合物的跨膜转运vir 基因表达的信号分子，单子叶植物不能被转化不是 农杆菌的 T-DNA 转移通道由多达 12 种蛋白组 缺少信号分子，而是由于这类分子仅在特定的发育时 成，包括两个主要部分:纤毛附属丝(或纤毛)和 期的特定部位产生，并且不能在单子叶植物的微管系 膜结合复合体。该通道也可称为 T-复合体运输器， 统中运输造成的。Vijayachandra 等人也发现在单子叶 [11]由 virB 编码的 11 种蛋白和 VirD4 蛋白组成。VirB1 植物的盾片中可能含有 vir 基因的诱导子。因此， 可在细菌膜上为 T-复合体运输器的装备提供位点; 单子叶植物中的确存在着能诱导vir 基因表达的物质 VirB2 和 VirB5 可被移动到细胞表面形成纤毛;其 但在内源信号不足的情况下必须添加外源信号物质 [12] 余的 VirB、VirD4 为 T-复合体的运输提供能量。合 才能提高农杆菌转化效率。 参考文献: 成的 T-复合体经过 T-复合体运输器，以类似于细菌 [1]李卫、郭光新、郑国锠,根癌农杆菌介导遗传转转导过程的方式注射到植物细胞内，并在 VirD2 和 化研究的若干新进展,J,,科学通报,2000,45,798-VirE2 的核定位信号(NLS)序列引导下，以 VirD2 807 重庆三峡学院学报 2006 年第 3 期 2001:60-65.电子波的相位，因而破坏了电子波的相位相干性， 这使谐振峰大为下降，峰宽变宽。如果散射中心太 [3]DAI QI.One the Resonant States of Symmetric 多，谐振效应可能完全被破坏。 one-dimensional Double Barrier[J]. 复旦学报, 3、小结 2000,39(2):103-106. 本文分析和计算了一维双势垒结构发生谐振 隧穿效应的物理机制、条件和透射几率，发现在发 [4]李存志等.粒子在 n 个一维方势垒中的共振隧穿 生谐振隧穿效应时双对称势垒对入射电子是完全透 [J].西安电子科技大学学报,1997,24(2):78-80. 明，无反射波，同时也指出在一维双势垒结构中发 [5]Zhang Li. Influences of.Electric Field On Electro-生谐振隧穿效应时入射电子的能量等与一维无限深 势阱中电子情况基本一致。 optic Effects in a Semi-parabolic Quantum Well[J].量子参考文献: 光学学报,2003,9(1):52-55. [1]周世勋.量子力学 教程 人力资源管理pdf成真迷上我教程下载西门子数控教程protel99se入门教程fi6130z安装使用教程 [M].北京,人民教育出版 ,责任编辑,朱 丹,社,1999:44-50. [2] 曾谨言.量 子力学 [M].北 京,科学出 版社, Resonance Effect in One Dimension Double Barriers Structure XU Gang (The Electronic Engineering Dept., Chongqing Three Gorges University, Wanzhou 404000,Chongqing) Abstract: When one dimension double barries structure exists resonance effect, we analyze its physical mechanism and condition. At the same time we also caculate its transmission probability. We find the motion of electrons in this structure almost agrees with it in one dimension infinitive deepth well. Key words: Quantum eff ect, Tunneling effect, Resonance effect. 1993,22,:491-560., 上 接 82 页 , weight DNA into plant [10]Ishida Y, Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, chromosomes[J].ProcNatlAcadSciUSA,199 6,93,:9975-9979. Kumashiro T. 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