蛋白质测定方法的比较

蛋白质测定方法的比较 原理 时间 应用范围 优缺点 凯氏定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生8,10小适用于0.2~ 用于 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 蛋白质 氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。时 1.0mg氮，误差含量的准确测 经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸为 ?2, 定;干扰少;费 至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算时太长 得样品之氮含量。 双缩尿法 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两 个分子20~30分适用于用于快速测定， 脲经180?左右加热，放出一个分子氨后得钟 1~10mg蛋白但不太灵敏;不 到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与质 同蛋白质显色相 CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。似 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键， 或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化 合物都有双缩脲反应。 Folin,酚试此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只40,60灵敏度高，耗费适用于~5mg 剂法 是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，分钟 时间长;操作要蛋白质 以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵 倍) 严格计时;颜色 敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因深浅随不同蛋白 是:在碱性条件下，蛋白质中的肽键与质变化; 标准曲 铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的线不是严格的直 磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨线形式，且专一 酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色(钼性差 兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下， 蓝色深度与蛋白的量成正比。 紫外吸收法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸5,10分适用于50,用于层析柱流出 残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸钟 100mg蛋白质 液的检测;核酸 收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，的吸收可以校 其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正正;不消耗样品， 比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收测定后样品仍能 值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋回收利用 白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比 关系，可以进行蛋白质含量的测定。 考马斯亮蓝考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋5,15分适用于1,5mg较好的方法;干 法 白质结合，使染料的最大吸收峰的位置钟 蛋白质 扰物质少;颜色 (lmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜稳定; 颜色深浅 色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料随不同蛋白质变 主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精化; 标准曲线有 氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 轻微的非线性 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白 质浓度成正比。 我的看法: 关于蛋白质的鉴定方法在不断的更新进步,技术也在不断革新。考马斯亮蓝法是 目前应用最广的方法之一，合适的方法为鉴定带来了诸多便利。所以我们需要在不断的思考 和实践中进步。 林学11-1 110114130 陈桂莲 蛋白质检测 双缩脲 双缩脲试剂是由双缩脲试剂A和双缩脲试剂B两种试剂组成. 双缩脲试剂A的成分是氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的水溶液; 双缩脲试剂B的成分是硫酸铜的质量分数为0.01 g/mL的水溶液。 双缩脲试剂可以验证蛋白质的存在。 具体方法是: 先将双缩脲试剂A加入组织样液，摇荡均匀(必须营造碱性环境)，在加入双缩脲试剂B，摇荡均匀。如果组织里含有蛋白质，那么会看到溶液变成紫色。具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫色反应。蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色的化合物。颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 双缩脲(NH2CONHCONH2)是两个分子脲经180?左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。 双缩脲试剂本是用来检测双缩脲，因蛋白质中也有-CONH-基也可用于检验蛋白质，与蛋白质接触后的颜色呈紫色。 考马斯亮蓝 科技名词定义 中文名称: 考马斯亮蓝 英文名称: Coomassie brilliant blue 定义: 属于三苯甲烷类染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合体。考马斯亮蓝R250多用 于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色;考马斯亮蓝G250是布拉德福德 (Bradford)蛋白质定量试剂的主要成分。 应用学科: 生物化学与分子生物学(一级学科);方法与技术(二级学科) 以上 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录 工贸企业有限空间作业目录特种设备作业人员作业种类与目录特种设备作业人员目录1类医疗器械目录高值医用耗材参考目录 化学性质 考马斯蓝染色 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 1. 1(Bradford浓染液的配制: 2. 2(标准曲线蛋白质样本的准备: 3. 3(溶解: 4. 4(稀释: 5. 5(作用: 6. 6(计算: 处理方法 展开 化学性质 考马斯蓝染色 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 1. 1(Bradford浓染液的配制: 2. 2(标准曲线蛋白质样本的准备: 3. 3(溶解: 4. 4(稀释: 5. 5(作用: 6. 6(计算: 处理方法 展开 编辑本段化学性质 分子结构如右图 Coomassie brilliant blue G-250 考马斯亮蓝有G250和R250两种。 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm;当它与 蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。 其光吸收值与蛋白质含量成正比。 考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条带染色。 编辑本段考马斯蓝染色 coomassie blue一定范围内与蛋白质浓度成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0,1 000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。 编辑本段考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0(2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于细胞骨架的检验。 1(Bradford浓染液的配制: 将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇，加入100mL浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200mL，此染液放4?至少6个月保持稳定。 2(标准曲线蛋白质样本的准备: 尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之间绘制标准曲线。 3(溶解: 将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。 4(稀释: 按1:5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。 5(作用: 每个样本加5mL 稀释的染料结合溶液，作用5,30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min( 6(计算: 根据标准曲线计算待测样本的浓度。 编辑本段处理方法 考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。 气相色谱法测定蛋白质,方法快速准确、灵敏、重现性好,操作简便,其最低检出限为0.5,