微生物实验报告

微生物实验报告 1 微生物在物质转化中的作用 1.1 微生物可降解纤维素的实验设计 1.1.1 实验目的 纤维素(cellulose)是由葡萄糖组成的大分子多糖。不溶于水及一般有机溶剂。是植物细胞壁的主要成分。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上。一般的微生物难以降解纤维素。为证明存在能使纤维素降解的微生物，故设计本实验。 1.1.2 实验原理 有些细菌具有分解纤维素的能力，可以分泌纤维素酶，使纤维素水解。测定细菌对纤维素的水解常采用纤维滤纸，通过液体培养或固体培养进行试验。经过培养后的滤纸条被分解发生断裂或失去原有物理性状，从而可以判断细菌能否分解纤维素。 1.1.3 实验药品和仪器 样品:新鲜土样 无机盐基础培养基:硝酸铵1.0g、氯化钙0.1g、磷酸氢二钾0.5g、氯化铁0.02g、磷酸二氢钾0.5g、酵母膏0.05g、七水合硫酸镁0.5g、氯化钠1.0g、水1000ml，pH7.0~7.2 (固体培养基需加琼脂2%) 仪器:平皿、接种环、中性滤纸、试管、灭菌锅、无菌操作台、烧杯、锥形瓶 1.1.4 实验步骤 a好氧培养法 ?将无机盐基础培养倒平板，在固体培养皿上铺上滤纸，需要对照试验: ?接种后的培养基和没接种的空白样都放入35,37?条件下培养10,15天; ?取出试管观察培养液中滤纸有无被分解而透空的地方。 b厌氧法 ?将无机盐基础培养基分装试管，在培养基中浸泡一条5,7cm优质滤纸，需要对照试验: ?接种后的培养基和没接种的空白样都放入35,37?条件下培养10,15天; ?取出试管观察培养液中滤纸有无被分解而透空的地方。 1.1.5实验现象与结果分析 a好氧培养法实验现象 scope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient State-owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research 图1-2 好氧法空白对照 图1-1 好氧法样品 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 b厌氧培养法现象 图1-3 厌氧法样图1-4 厌氧法空白对照 品 c实验结果分析 根据实验结果，可以得出以下结论: (1)两种方法下滤纸都被腐蚀，说明无论是好氧还是厌氧条件下，都存在可以降解纤维素的微生物。由因为采集的土样地点较集中(我参加了取样工作)，由此推测该微生物很有可能是兼性菌。 (2)好氧法中的滤纸远比厌氧法的腐蚀得更严重，说明在好氧条件下，纤维素降解微生物生长更旺盛。这可能是由微生物本身性质和环境条件(特别是氧气含量)决定的。 1.2 生物对氨氮有生物催化作用的实验设计 1.2.1实验目的 4+2-3证明存在能将NH转化成NO和NO的微生物 1.2.2实验原理 有HNO产生时，加格里斯试剂A液和B液出现绛红色，如果有硝酸存在时，加入二2 苯胺试剂则出现蓝色。 1.2.3实验器材及试剂 a实验试剂 硝化作用培养基:0.2%(NH4)SO、0.1%KHPO、0.05%MgSO?7HO、0.2%NaCl、2424420.04%FeSO、0.5%CaCO，120?灭菌30min. 43 格里斯试剂: A液:0.5g对氨基苯磺酸溶于150mL10%醋酸溶液中，保存于棕色瓶中 B液:α-萘胺0.1g、蒸馏水20ml、10%稀醋酸150ml,保存于棕色瓶内。 二苯胺试剂:0.1g二苯胺溶于20ml蒸馏水中，然后缓缓加入100ml浓硫酸，保存 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to2 于棕色瓶子中。 b实验仪器 三角瓶、培养箱、电子秤、比色碟、试管、滴管、超净台、高压灭菌锅 1.2.4实验步骤 ?取样:取1g左右样品土壤接于硝化作用培养基的三角瓶中; ?放入28,30?培养箱中培养7,17天 ?检查结果 取培养液于试管中，加格里斯试剂A液与B液各数滴，观察样品的颜色变化，并记录。 4+2-3-若上述现象都有了，则说明有微生物能将NH转化成NO和NO 1.2.5实验现象与结果分析讨论 a实验现象 再加B液 加A液 加B液 加A液 加B液 图1-6样品组 图1-5空白对照组 b实验结果分析 格里斯试剂A液和B液加入样品后，只有加入B液的样品出现绛红色，说明了溶液 4+2-产生了HNO，可反推出存在能将NH转化成NO的微生物。而加入二苯胺试剂的样品都2 4+3-没有出现预期效果，不能说明是否存在能将NH转化成NO的微生物，只能说明操作不当，实验失败。 1.3聚磷菌蓄磷 1.3.1实验目的与要求 ? surance, education, scientific researchowned enterprises staff, finance, in-f public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient Statens). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff oscope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loa3 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 1.3.2实验原理 微生物除磷的原理主要是用聚磷菌在厌氧—好氧过程中，聚磷菌在厌氧池中为优势菌种，构成了活性污泥絮体的主体并吸收低分子的有机物，同时将贮存在细胞中聚合磷酸盐(Poly-p)中的磷通过水解而释放出来，并提供必需的能量。而在随后的好氧池中，聚磷菌所吸收的有机物将被氧化分解，并提供能量，同时能从污水中变本加厉地、过量地摄取磷，在数量上远远超过其细胞合成所需的磷量，将磷以聚合磷酸盐的形式储藏在菌体内而形成高磷污泥，并且通过剩余污泥系统排出，因而可获得相当好的除磷除果。 1.3.3 实验器材及试剂 a培养基配方 废水合成培养基:葡萄糖0.3g/L;无水乙酸钠0.15 g/L;蛋白胨0.1 g/L;酵母粉0.01 g/L;氯化钠0.05 g/L;磷含量为5或10mg/L(对应磷酸二氢钾0.0219、0.0439 g/L);二水合硫酸镁0.15 g/L;氯化铵0.18 g/L;pH7.0,7.2。 b其他试剂: ?5%的过硫酸钾溶液 ?磷酸盐储备液 ?10%的抗坏血酸溶液(现配先用) ?钼酸盐溶液 c 实验仪器 灭菌锅、离心机、分光光度计、(50ml、100ml)锥形瓶、50ml具塞比色管若干支、10ml具塞比色管2支、移液管数支、烧杯 1.3.4 实验步骤 a聚磷微生物培养蓄磷步骤: i准备工作: 每组取上述配制好的废水培养基90ml分别分装于两个250ml锥形瓶中，50ml分装于150ml锥形瓶; 剩余的新鲜培养基直接用于测定培养基上清液含磷浓度。10ml具塞比色管2支，离心管数支，10ml吸量管数支，包扎包扎好，灭菌。 ii扩大培养阶段: 将聚磷微生物菌株分别接种于装有50ml培养液的锥形瓶中，30?，140rpm振荡扩大培养12h左右。 iii厌氧阶段: 将扩大培养后的培养液装满10ml具塞比色管，塞紧不留气泡，烛缸法厌氧30?培养3h。 iv好氧阶段: 取10ml厌氧培养液直接接种于250ml锥形瓶的新鲜培养液中，好氧培养24小时后测上清液的磷浓度。 1.3.5磷酸盐标准曲线的绘制及浓度的测定 a水质总磷的测定(钼酸铵分光光度法) owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to4 i主题内容与适用范围 本标准的最低检出浓度为0.01mg/L ，测定上限为0.6mg/L ，在酸性条件下，砷、铬、硫干扰测定。 ii原理 在中性条件下用过硫酸钾(或硝酸-高氯酸)使试样消解，将所含磷全部氧化为正磷酸盐。在酸性介质中，正磷酸盐与钼酸铵反应，在锑盐存在下生成磷钼杂多酸后，立即被抗坏血酸还原，生成蓝色的络合物。 iii试剂 硫酸(HSO,密度为1.84g/mL) 、硝酸(HNO,密度为1.4g/mL)、高氯酸(HClO:2434优级纯，密度为1.68g/mL )、 硫酸(H2SO4) , 1+l 。硫酸，约c(1/2H2SO4 )=1mol/ L :将27mL 硫酸(3.1)加入到973ml水中。 氢氧化钠(Na0H) , 1mol/L 溶液:将40g 氢氧化钠溶于水并稀释至1000mL 。 氢氧化钠(NaOH) , 6mol/L 溶液:将240g氢氧化钠溶于水并稀释至1000mL 。 过硫酸钾，50g/L 溶液:将5g过硫酸钾(KSO)溶解于水，并稀释至100mL 。 223 抗坏血酸，100g/L 溶液:溶解10g抗坏血酸(CHO)于水中，并稀释至100mL。686 此溶液贮于棕色的试剂瓶中，在冷处可稳定几周。如不变色可长时间使用。 钼酸盐溶液:溶解13g钼酸铵〔(NH)8MO0?4HO〕于100mL水中。溶解0.35g酒石酸47242 锑钾〔 KSbC4H407?1/2H2O〕于100mL 水中。在不断搅拌下把钼酸铵溶液徐徐加到300ml硫酸中,加酒石酸锑钾溶液并且混合均匀。 磷标准贮备溶液:称取0.2197 士0.001g于110?干燥2h 在干燥器中放冷的磷酸二氢钾( KH2PO4 ), 用水溶解后转移至1000mL 容量瓶中，加入大约800mL水,加5mL 硫 /ml磷(本溶液在玻璃瓶中可贮存至少酸用水稀释至标线并混匀。此标准溶液含50.0μg 六个月) 磷标准使用溶液:将10.0mL 的磷标准溶液转移至250mL 容量瓶中，用水稀释至标线并混匀。1.00mL 此标准溶液含2.0μg/ml磷(使用当天配制) iv测定步骤 溶液稀释:根据检测范围，把溶液稀释成一定的倍数 过硫酸钾消解:向试样中加2mL 过硫酸钾，将具塞刻度管的盖塞紧后包扎，放在大烧杯中置于灭菌锅中加热，待压力达1.1 kg/cm2，相应温度为120? 时，保持30 min 后停止加热。待压力表读数降至零后(取出放冷。然后用水稀释至标线。(加水至25ml刻度线) 注:如用硫酸保存水样。当用过硫酸钾消解时，需先将试样调至中性。 发色 :分别向各份消解液中加入0.5ml抗坏血酸溶液混匀，30s后加1mL钼酸盐溶液充分混匀。 b工作曲线的绘制 磷酸盐标准曲线的绘制:取7 支具塞刻度管分别加入0.00、0.25 、0.50 、1.50、 surance, education, scientific researchowned enterprises staff, finance, in-f public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient Statens). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff oscope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loa5 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 2.50 、5.00、7.50mL 磷酸盐标准溶液加水至12.5mL 。然后按测定步骤(iv)进行处理。以水做参比，测定吸光度。扣除空白试验的吸光度后，和对应的磷的含量绘制工作曲线。 i结果的表示 总磷含量以c ( mg/L )表示，按下式计算: c=m/v 式中:m ― 试样测得含磷量，μg; F ― 测定用试样体积, mL 。 c磷浓度的测定和除磷率的计算 按测定步骤(iv)进行处理。以水做参比，测定吸光度。根据测出的吸光度和工作曲线得出磷含量以及计算其除磷率 除磷率的计算: 除磷率=(初始磷浓度—除磷后的剩余磷浓度)/初始磷浓度)*100% 1.3.6实验数据记录与结果分析 a 标准曲线实验数据 表1-1 标准曲线实验数据 序号 1 2 3 4 5 6 7 项目 浓度(mg/L) 0 0.02 0.04 0.12 0.2 0.4 0.6 Abs 0.006 0.013 0.024 0.06 0.1 0.197 0.287 b样品实验数据 表1-2 样品实验数据 项目 原始培养基 大肠杆菌 聚磷菌 Abs 0.232 0.231 0.149 注:吸光度已经过校正 c标准曲线的绘制 根据表1-1的实验数据，绘制标准曲线，结果如图1-7所示: 0.35 Abs 0.3 0.25 0.22y = 0.4731x + 0.0049 = 0.9997 R0.15 0.1 0.05磷酸盐浓度mg/L 0 00.10.20.30.40.50.60.7 图1-7 磷酸盐标准曲线 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to6 d聚磷菌蓄磷效果计算 i根据标准曲线和样品实验数据(在测定时样品浓度稀释了25倍)，计算结果如表1-3所示: 表1-3样品浓度 项目 原始培养基 大肠杆菌 聚磷菌 Abs 0.232 0.231 0.149 样品浓度mg/L 12.000 11.947 7.615 ii蓄磷率的计算 ?大肠杆菌的除磷率 蓄磷率=(初始磷浓度—除磷后的剩余磷浓度)/初始磷浓度)*100% =(12.000—11.947)/12.000*100% =0.4% ?聚磷菌的蓄磷率 蓄磷率=(初始磷浓度—除磷后的剩余磷浓度)/初始磷浓度)*100% =(12.000—7.615)/12.000*100% =36.54% e结果分析讨论 可以看出，聚磷菌的蓄磷率远远高于大肠杆菌的蓄磷率，说明聚磷菌具有相当好的除磷效果。如果多做几种其他的细菌对磷的蓄积实验，则蓄磷菌蓄磷的相对优势更明显。 surance, education, scientific researchowned enterprises staff, finance, in-f public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient Statens). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff oscope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loa7 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 2 荧光原位杂交试验 2.1 试验仪器 高速离心机:可达36000转/分钟 高压灭菌锅:160?以上杀菌 恒温箱:为杂交提供恒定温度 荧光显微镜:捕捉荧光图片 恒温水浴锅 纯水机 2.2 试验所用试剂及配置方法 ?0.2mol/L(pH 7.4)磷酸缓冲溶液(PB) 试剂为NaH2PO4?2H2O和Na2HPO4?12H2O 。首先称取NaH2PO4?2H2O 31.2g，加重蒸水至1000mL溶解即为0.2mol/L的NaH2PO4溶液;称取Na2HPO4?12H2O 71.632g，加重蒸水至1000mL溶解即为0.2mol/L的Na2HPO4溶液。取19mL的NaH2PO4溶液和81mL的Na2HPO4溶液充分混合即为0.2mol/L(pH 7.4)磷酸缓冲溶液。常温保存。 (2)0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS) 试剂为NaCl和PB。称取NaCl 8.5g和0.2mol/L的PB 50mL，加入到1000mL的容量瓶中，最后加重蒸水至1000mL，充分摇匀即可。常温保存。 0.02mol/L的PBS，只需使PB的量加倍，即取100mL的PB即可。以此类推。 (3)4%多聚甲醛溶液 称取40g多聚甲醛，置于三角瓶中，加入500mL的0.1mol/L的PB，加热至60?左右，持续搅拌使粉末完全溶解，滴加少量1mol/L NaOH使溶液清亮，再用1mol/L的HCl将PH调至7.4，最后补足0.1mol/L的PB至1000mL，充分混匀即可。 (4)0.5mol/L(pH7.4)Tris-HCl缓冲液 主要试剂为Tris(三羟甲基氨基甲烷)。先用400mL蒸馏水溶解60.57gTris，加入大约420mL的HCl后，用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH将pH调至7.4，最后加重蒸水至1000mL。4?冰箱保存。 (5)铬矾明胶液 在1000mL烧杯中用800mL水加热溶解4g明胶，待其完全溶解后，再加入0.5g铬矾(十二水?碳酸钾铬)。在加热过程中需不停用玻棒搅动，以防止明胶烧糊。 (6)不同系列乙醇脱水液 表2-1不同系列乙醇脱水液 乙醇浓度(%) 50 80 100 无水乙醇体积10 10 10 (mL) 蒸馏水体积(mL) 8 2 0 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to8 (7)杂交缓冲液 总细菌、Rhodocyclus sp、Pseudomonas sp杂交液中去离子甲酰胺(DAF)浓度分别为0%、35%和20%去离子甲酰胺(DAF)，其余的相同，SDS 0.1%，Tris-HCl(pH7.4)20mmol/L，NaCl 0.9mol/L，不足部分以超纯水补齐。 (8)杂交清洗液 SDS 0.1%，Tris-HCl(pH7.4)20mmol/L，NaCl 225mmol/L，不足部分以超纯水补齐。 2.3 荧光探针 表2-2 三种菌的探针序列 细菌 探针名称 探针序列(5’—3’) 5’ —标记 总细菌 EUB338 5’ —GCTGCCTCCCGTAGGAGT—3’ Texas Red Rhodocyclus sp PAO651 5’ —CCCTCTGCCAAACTCCAG—3’ FITC Pseudomonas sp Ps 5’ —GCTGGCCTAGCCTTC—3’ FAM 表2-3 各探针的杂交条件 探针 杂交温度/? 杂交时间/h 甲酰胺浓度/% EUB338 42 2 0 PAO651 46 3 35 Ps 50 5 20 2.4实验步骤 (1)污泥浓度的测定 取一定量浓度适中的泥水混合液，搅拌使之成为悬浮状态。 (2)玻片处理 玻片先用NaOH溶液浸泡，自来水洗净后再用纯水冲洗干净，然后再160?烘干，保证彻底去除RNA酶。处理好的玻片放置无尘环境保存。 (3)样品处理 样品用4%的多聚甲醛固定20分钟(4%的多聚甲醛的体积为样品体积的15倍以上)。用高速离心机12000转/分钟，4?离心去除上清液，加入0.01mol/L的PBS清洗，离心去除上清液，重复3次，加入0.02mol/L的PBS，充分震荡，使之重新成为悬浮液。无法立即进行杂交的样品可以在细胞固定后加入体积比为1:1的乙醇:PBS，-20?条件下保存待用。 (4)杂交前的准备 用微升取样器取大约3μL的样品悬液，滴加到玻片上，阴暗处常温风干。风干后用50%，80%和100%乙醇脱水，风干。为了能让细菌有更好的通透性，使探针能够进入到细菌内，在风干后的样品上滴加大约9μL的不含探针的杂交液，预杂交2小时。 (5)杂交 取出经过预杂交的样品，用重蒸水清洗掉杂交液，风干后即可进行杂交。由于杂交对象为细菌体内的16S rRNA，因此可以省去变性这一步骤。 取探针3μL和9μL的杂交液，滴加到目标区域，盖上盖玻片，保证盖玻片内没有气泡 surance, education, scientific researchowned enterprises staff, finance, in-f public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient Statens). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff oscope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loa9 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 存在后用封片液封片。探针的量不宜过多，过多不仅造成浪费，而且影响杂交效果，导致高背景染色;杂交液的量也要适当，最好不要超过20μL，因为杂交液量过多常常容易导致盖玻片滑动脱落，影响杂交结果。将玻片放置到湿润的暗盒中(盒内放入纱布，杂交液润湿)，在恒温箱中进行杂交。 (6)杂交后洗涤 从恒温箱中取出玻片之前将盛有清洗液的容器放入到48?的水浴中预热20分钟。杂交完成后取出玻片，立即放入到预热好的容器中。注意不能让玻片干燥，不然将很难洗去非特异性结合的信号，增加背景染色。清洗液的量应当淹没玻片，并作适当摇晃，使盖玻片滑落。清洗20-30分钟后取出，用清水洗去剩余的清洗液，用吸水纸吸干后即可进行观察。 (7)结果显示观察 完成清洗的玻片需要在显示系统上进行观察，观察时需要选定适宜的激发光波长和放大倍数。图像的摄取一般使用与荧光显微镜相连的CCD照相机，取得照片后再进行分析。 所用不同荧光材料的即发光和发射光波长及滤镜选择 2.5实验结果现象与分析讨论 2.5.1 实验结果现象 图2-2 Rhodocyclus sp 在蓝光下的图像 图2-1 总细菌在绿光下的图像 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to10 图2-3 Rseudomonas sp在蓝光下的图像 2.5.2 实验结果分析讨论 在荧光显微镜下观察到总细菌在绿光下的照射下发出红光，Rhodocyclus sp 在蓝光下的照射下发出绿光，Rseudomonas sp在蓝光下的照射下发出黄光。实验结果初步达到要求，不足之处是由于操作的失误，导致全部被染上染料，真正植入荧光探针的细菌只有局部小区域。所以在观察的时候花了不少时间。加之没有事先了解荧光显微镜的操作步骤，造成耗费了不少时间研究学习这个仪器的使用方法。 另外，由于之前没有做空白对照试验，所以也无法完全确定荧光显微镜显示的是否是我们要观察的。只能靠指导老师的经验大致推测目标细菌在不同波长下发出的颜色。 这个实验给我的启示是:无论做什么试验，都要先确定好方案，做好充分准备。如果没有做足准备工作就贸贸然开始，就可能导致像这次试验一样的失误发生。当然，团队合作对一个人的发展也是很重要的。 surance, education, scientific researchowned enterprises staff, finance, in-f public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient Statens). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff oscope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loa11 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 3 分子生物学试验 3.1实验目的 实验过程中，主要通过碱裂解法提取质粒DNA大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备、感受态细胞的转化以及目的蛋白质gfp的正常表达，来完成一系列分子生物学基础实验。 通过本实验，学习并掌握碱裂解法、氯化钙法制备感受态细胞的制备及采用α互补现象进行重组DNA鉴定的原理和方法。 3.2 实验原理 质粒是细菌内共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞特定的表型，经过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的用途。 本次实验中，分子克隆质粒载体T所携带的外源基因是gfp绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将gfp基因插入表达载体P中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。 为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过Hand?和NCO?两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段gfp和表达载体-P质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断gfp基因工程菌的构建效果。 实验流程图 3.3 ? 质粒DNA的提取与纯化 碱液裂解法;乙醇洗涤化 (T-gfp质粒作为克隆载体、P32作为表达载体) ? 通过观察电泳图片，来鉴定T、P 两种质粒DNA的提取结果 琼脂糖凝胶电泳 ? 大肠杆菌感受态细胞的制备 氯化钙法 ? 将连接后的重组DNA分子导入大肠杆菌感受态细胞 感受态细胞的转化 r? 重组子的筛选 含有Kana的重组 子才能在Kana平板上 生长 ? 目的基因的重组子进行诱导表达 重组DNA分子的鉴定在平板 图3-1 gfp基因工程菌的构建与表达 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to12 3.4 质粒DNA的提取 3.4.1 实验概述 a分子克隆载体 载体是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。 因此，作为载体应该满足以下几方面的要求:?有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个;?外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段;?有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出;?具有促进外源DNA表达的调控区。 重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒(cosmid)和噬菌体M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是:?都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制;?都很容易同细菌DNA分开并加以纯化;?都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。 -gfp质粒。 在本次实验中，我们所选择的克隆载体是大肠杆菌T 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1 kb至200 kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 目前，质粒已成为最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。有许多方法可用于质粒DNA的提取，本次实验采用碱裂解法来提取T质粒的DNA。 b表达载体 将外源基因插入载体中，使其处于一系列的E.coli表达信号的控制之下。这样基因可以转录和表达。克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称为表达载体。 大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中 在本次实验中，我们所选择的表达载体是大肠杆菌PBR322质粒。 surance, education, scientific researchowned enterprises staff, finance, in-f public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient Statens). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff oscope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loa13 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 c绿色荧光蛋白(GFP) green fluorescent protein，简称GFP，这种蛋白质最早在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。 在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。 GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450,490nm蓝光波长下更稳定。 由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。 3.4.2 实验目的 ?通过用LB培养液培养含有T-gfp质粒和PBR322质粒的大肠杆菌。 ?利用“碱裂解法”从大肠杆菌中提取出T质粒和P质粒的DNA，然后用乙醇洗涤沉淀，达到纯化质粒DNA的目的。 .4.3 实验原理 3 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为:当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法，通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，可经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤来纯化质粒DNA，故在分子生物学实验室中常用。 所以，在本次实验中，我们采用了“乙醇沉淀法”来洗涤DNA沉淀物，去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求。 3.4.4 实验仪器、材料及试剂 ?仪器 微量移液枪、微量离心管、台式高速离心机、干燥机、高压蒸汽灭菌锅、常用玻璃器皿等。 ?材料 含有T-gfp质粒和PBR322质粒的大肠杆菌DH5?。 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to14 ?试剂 ?用于碱法提取质粒DNA的三种溶液 表3-1 碱法提取质粒DNA的三种溶液 试剂名称 试剂成分及含量 50 mmol/L葡萄糖，10 mmo/LEDTA，25 mmol/L Tri-HCl(pH=8.0)，溶液?(GET缓冲液) 用前加 溶菌酶4 mg/mL 溶液?(变性液) 0.2 mol/LNaOH，1,SDS 溶液?(乙酸钾溶60 mL的5 mol/L KAc，11.5 mL冰醋酸，28.5 mL H2O 液) ?其他试剂 卡那霉素(Kana)，100%乙醇，70,乙醇溶液 3.4.5 操作步骤 a培养大肠杆菌使质粒扩增 (1)配制LB液体培养基 将下列组分溶解到0.9 L水中，让后再将水补足至1 L: 表3-2 LB液体培养基配方 成分 含量 蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g 氯化钠 10 g 1 mol/L NaOH 调整至pH=7.0 1 L的LB培养液配制好之后，分别分装到4个三角瓶中，250 mL/个。然后放置到高压蒸汽灭菌锅中灭菌1.5,2 h。灭菌后取出移至超净工作台，冷却到47 ? 卡那霉素(Kana)。 左右，每瓶培养液分别加入5 μL的 (2)培养大肠杆菌 将带有质粒T-gfp和PBR322的大肠杆菌单菌落，接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基2,5 mL中，然后放置在恒温37 ?的摇床中培养8,16 h。 加入AMP的目的:AMP可以抑制宿主的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可以继续复制，若干小时后，拷贝数持续递增。 b收集和裂解大肠杆菌 (1)取含有质粒T、P的大肠杆菌液体培养液1.5 mL分别装于微型离心管中，转速8 000转/min离心1 min，去掉上清液，加入100 μL溶液?，充分混匀后室温下放置5 min。 溶液?的作用:所含有的EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和抑制微生物生长，加入EDTA可以把大肠杆菌细胞中所有的二价金属离子都螯合掉。 (2)加入200 μL新配制的溶液?，颠倒2,3次使之混匀，冰上放置5 min。 surance, education, scientific researchowned enterprises staff, finance, in-f public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient Statens). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff oscope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loa15 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 溶液?的作用:十二烷基酸钠(SDS)可以使细胞壁破裂。经SDS处理后，在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都会发生变性。 注意:一是操作时间不能过长，因为在此碱性条件下染色体DNA片段会慢慢断裂;二是操作时动作要温和，振荡激烈也使染色体DNA片段断裂。 (3)加入150 μL冰冷的溶液?，轻轻颠倒数次使之缠绕均匀，冰上放置5 min。 实验现象及溶液?的作用:溶液?加入后，我们可以观察到离心管内出现白色沉淀。KAc中的K离子把SDS中的Na离子置换出来从而形成了不溶性的PDS，由于K离子置换所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质也沉淀下来，同时大肠杆菌的染色体DNA也一起被共沉淀了。醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，一旦发生断裂，染色体DNA就不可能被共沉淀了。 此时，质粒DNA很快可以复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可以得到质粒DNA。 c分离和纯化质粒DNA (1)用台式高速离心机，转速12 000转/min离心5 min，将上清液移入另一干净的离心管中，并加入1mL100%的乙醇混匀，室温放置5 min，转速12 000 ,8 min，弃去上清液。 转/min离心5 (2)沉淀用70,乙醇清洗一次，离心管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。 加入异丙醇和乙醇的作用:因为有部分蛋白质还未被沉淀出来，所以要用异丙醇进行抽提，然后进行乙醇沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为掺入DNase而发生降解。加入异丙醇后，溶液界面的分层就会更清晰，便于沉淀的回收。 回收后的沉淀因为可能含有一定的盐类，因此要加入乙醇洗涤沉淀，将盐去除。 (3)每支离心管加入30 μL无菌水，然后室温放置10 min，使质粒DNA充分溶解。 3.4.6 实验结果 得到分别含有T-gfp质粒和P质粒的样品溶液，各装于两支干净离心管中，待进行电泳检测。 3.5琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的提取效果 3.5.1 实验概述 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种杂聚多糖，是由D型和L型半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷键相连形成的线状高聚物。琼脂糖遇冷水膨胀，溶于热水成溶胶，冷却后成为孔径范围从50 nm到大于200 nm的凝胶。 琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段最为常用的方法之一，这种方法简便易行。而且琼脂糖可以灌制成各种形状、大小和孔径，在不同的装置中进 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to16 行电泳，如果有必要，还能够从凝胶中回收DNA谱带。 3.5.2实验目的 ?采用琼脂糖凝胶电泳的方法，对样品进行检测，目的主要是为了观察染色后的凝胶上有否出现清晰的条带。 ?观察结果，如果出现清晰的条带，则证明了T-gfp质粒和P质粒被成功提取出来，而且含量足够;如果条带不清晰，则说明了样品中提取的质粒含量较少，不利于后续操作。 3.5.3 实验原理 DNA带负电，如果样品中含有质粒DNA，那么，在电场作用下，DNA可以在琼脂糖凝胶板上向阳极移动。不同长度的DNA片段会表现出不同的迁移率，因而可根据DNA分子的大小来使之分离。经过EB染色后，在紫外灯照射下可以观察到琼脂糖凝胶板上有否出现清晰的条带，来判断质粒DNA的提取结果。 3.5.4 实验仪器、材料及试剂 ?仪器 电泳仪、灌胶模具及梳齿、电泳槽和紫外投射仪。 ?材料 待检测的质粒DNA样品、琼脂糖。 ?试剂及上样液 ?TBE缓冲液(10×) 称取Tri 108 g，硼酸55 g，0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)40 mL，用H2O定容到1000 mL，高压灭菌作为10×贮液;稀释10倍后作为工作溶液使用。 ?上样液 0.25,溴酚蓝，质量浓度为40,的蔗糖水溶液。 ?溴化乙啶染色液(10 mg/mL) 在20 mL H2O中溶解0.2 g溴化乙啶，混匀后于4 ?避光保存。 3.5.5 操作步骤 a1,琼脂糖凝胶的制备 取250 mL三角瓶，加入100 mL TBE缓冲液，称取1 g琼脂糖加入缓冲液中，用包装纸封好瓶口，然后将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂溶解。 b胶板的制备 将有机玻璃内槽洗净、晾干，放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷却至65 ?的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心地倒在内槽上，使胶液慢慢地展开直到整个玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置15 min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，将铺好胶的玻璃内槽放入装有电泳缓冲液TBE的电泳槽中。 c加样 surance, education, scientific researchowned enterprises staff, finance, in-f public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient Statens). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff oscope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loa17 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 使用微量移液枪将3 μL溴酚蓝上样液与15 μL质粒DNA样液混合均匀，然后用移液枪将总共18 μL的样品加入到胶板的样品孔内。每加完一个样品，要换一个枪头。加样时要避免将样品滴出到样品孔外。 d电泳 加样后的凝胶板可以通电进行电泳。采用在150 V的电压下进行室温电泳。因为DNA是带负电的，通电时，我们可以观察到样品向阳极移动。电场强度不应高于5 V/cm，当溴酚蓝移至距离胶板下沿约1 cm时，停止电泳。 e染色和观察 从电泳槽中小心地取出凝胶，并将凝胶置于EB染色剂中染色8 min左右，然后用清水冲洗凝胶。最后将凝胶置于紫外灯下观察。DNA存在处会显示出红色的荧光条带。 EB染色原理:EB能插入DNA分子的碱基对之间，完成与DNA结合，DNA所吸收的260 nm的紫外线传递给EB，或者结合的EB本身在300 nm和360 nm吸收的射线均可在可见光谱的红橙区，以590 nm波长发射出来。 注意:?EB是一种强诱变剂，取用含有这一染料的样品时必须戴手套;?紫外线对人体、眼睛有危害性，在紫外灯下观察时，应带上防护眼罩或面罩，避免受紫外线损伤。 3.5.6 实验现象与结果分析 a电泳现象 ?装置图 图3-1 电泳装置图 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to18 图3-2 质粒DNA的琼脂凝胶电泳 b染色观察 在紫外灯下，可以观察到样品的情况，如下图所示: 图3-3样品电泳鉴定结果 c结果分析讨论 成功的实验，其样品电泳结果应该是在紫外灯照射下，琼脂块呈现多条并列的红色亮柱，亮柱其起始端(之前电泳时接负极段)附近有应该是一小段集中而明亮的片段。中间暗下来，接近末端是有有小段亮柱。从实验的结果看，基本上没有哪一组到达要求，都是这块琼脂呈现从头到尾多条亮柱。说明我们在操作时没有按照严格操作规程来，实验技能有待提高。 3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 3.6.1 实验概述 连接反应中形成的重组子及其它质粒分子的混合群体必须通过转入宿主细胞 surance, education, scientific researchowned enterprises staff, finance, in-f public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient Statens). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff oscope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loa19 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 将它们相互分离，进而进行自主复制。 但是，在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 人们发现，用含Ca2+的溶液处理的大肠杆菌细胞将会易于吸收外源DNA，这一过程称为转化。 3.6.2 实验原理 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，KCl)等化学试剂法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子，即带有异源DNA分子的受体细胞。 本次实验所采用的制备感受态细胞的方法是氯化钙法，CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15,的无菌甘油于-70 ?保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。 3.6.3 实验目的 通过采用氯化钙法，使大肠杆菌DH5?的细胞的通透性发生改变，从而制备出能容许含有外源DNA gfp荧光蛋白基因的质粒载体通过的感受态细胞。 3.6.4 实验仪器、材料及试剂 1、仪器 恒温摇床、电热恒温水浴、分光光度计、超净工作台、微量移液枪、高速冷冻离心机、无菌微量离心管、10 mL离心管、常用玻璃器具。 2、材料及试剂 E.coli DH5?作为受体细胞、LB培养液、0.1 mol/L CaCl2(含20,甘油)、冰块、无菌水。 3.6.5 操作步骤(氯化钙法) ?将单个菌落接种于含LB培养液的试管中，37 ?振荡(250 转/min)培养 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to20 过夜。 ?向装有100 mL LB培养液的500 mL三角瓶中各加入1 000μL(接种量为1,)过夜培养细胞，37 ?振荡培养至光密度(OD600)值为0.4,0.6(需2 h)。 ?将装有培养液的三角瓶一并移至超净工作台，然后用移液枪将培养物分别移入10 mL的离心管中，并置于冰上保持20 min。于4 ?离心3 min，弃去上清液。 ?往离心管中加入无菌水并再离心6 min，弃去上清液(用于去除溶液中残留的盐)。 ?向离心管中加入10 mL CaCl2溶液，小心混合均匀，并于4 ?离心3 min，弃去上清液。 ?再往离心管中加入5mL冰冻的含有20,甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液，并使沉淀悬浮于溶液中，再于4 ?离心3 min，小心地将官底沉淀刮离管壁，并使之混匀。 甘油的作用:保护细胞免受冰晶形成的伤害。 ?将所得溶液分装于20个微量离心管中，100 μL/个，并置于4 ?冰箱中贮存备用。 3.6.6 提高细胞感受态效率的方法 1、培养基的装量:培养基的装量关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为:培养基体积/三角瓶容量=100 mL/500 mL，50 mL/250 mL。 2、培养基的pH值:这里讲的pH值还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌株振荡培养好后，pH值不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，有利于保持感受态效率。 3、培养基中的各种离子:经实验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用MgCl2作为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。 4、在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。 5、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保 surance, education, scientific researchowned enterprises staff, finance, in-f public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient Statens). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff oscope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loa21 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 存于超低温冰箱内。 3.7 重组质粒DNA分子导入大肠杆菌感受态细胞(转化) 3.7.1 实验目的 将连接后、带有gfp基因的P质粒载体分子导入到大肠杆菌感受态细胞中，从而制备出转化子。 3.7.2 实验原理 转化，是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 在一定条件下，将带有外源DNA载体分子与感受态细胞混合保温，使载体DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞表现出新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以筛选出转化体，即带有外援DNA分子的受体细胞。 3.7.3 实验仪器、材料及试剂 ?仪器 恒温水浴锅、恒温摇床、微量移液枪。 2、材料及试剂 连接后的产物、待用的大肠杆菌感受态细胞、冰块。 3.7.4 操作步骤 1、用移液枪将连接后的产物(即重组DNA分子)100 μL分装于4支干净离心管中，25 μL/支。 2、从冰箱中取出制备好的大肠杆菌感受态细胞，并放在冰上待其溶化后，取100 μL加入每支离心管中，混匀并在冰上静置20 min。 3、将离心管放入42 ?水浴中2 min对细胞进行热处理。 目的:热处理会诱导涉及DNA修复的酶以及其他细胞成分的生成，这样可以导致细胞从转化过程的不正常状态恢复过来，提高了转化效率。 4、向上述试管中，加入1 mL预热(37 ?)的LB培养液，于37 ?下，振荡培养(250 转/min)1 h。 3.7.5 提高转化率要考虑的因素 1、细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4 ?的培养菌，最好从 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to22 ,70 ?或-20 ?甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD 600来控制。 DH5α菌株的OD 600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。 2、质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。 3、试剂的质量: 所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。 4、防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 3.8 重组质粒DNA分子的平板筛选 3.8.1 实验目的 将转化后的大肠杆菌培养液接种于卡那霉素(Kana)的LB培养基中，培养后观察培养基上菌落的生长情况，从而判断受体细胞有无成功转入含有目的基因gfp的重组质粒分子。 3.8.2 实验原理 由于本实验所采用的T、P两种质粒上都携带有抗生素(氨苄青霉素)抗性基因Ampr，我们可以通过Amp抗性来筛选转化子。若将转化的细胞涂布于含有氨苄青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒(即带有Ampr的转化子)的大肠杆菌细胞才能够在平板上生长繁殖。 如果受体细胞没有转入P质粒，那么则不能在含有Amp的培养基上生长。而能够在含有Amp的培养基上生长的受体细胞(转化子)就可以确定是已经成功导入了P质粒。 3.8.3 实验仪器、材料及试剂 1、仪器 超净工作台、微量移液枪、37 ?恒温培养箱、常用玻璃仪器。 2、材料及试剂 surance, education, scientific researchowned enterprises staff, finance, in-f public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient Statens). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff oscope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loa23 广东工业大学现代分子生物技术实验报告 转化培养液、LB培养液、卡那霉素。 3.8.4 操作步骤 1、制备含有卡那霉素的LB固体培养基 (1)在超净工作台中，用微量移液枪将Amp加入到装有LB培养液的三角瓶中(每1 mL培养液加入1 μL的Amp)，并轻摇混匀。 (2)将培养液倒入培养皿中，以制备LB平板(10 个)。 2、接种 (1)取10 μL转化培养液平铺于各个含有Amp的LB培养基上，平板静置10 min待培养液被吸收。 (2)将平板倒置并置于37 ?恒温培养箱中培养12,16 h，观察菌落的生长状况。 3.8.5 实验现象与结果分析 实验观察到卡那霉素的LB平板中，每个平板上都均匀地生长着零星的大肠杆菌菌落，菌落带有淡绿色。上述现象说明转化反应中，成功导入含有Ampr的P质粒的受体细胞能够在抗氨苄的LB培养基上生长，这些受体细胞正是我们要获取的转化子。 不过，由于琼脂平板中缺乏诱导底物IPTG，所以重组子所含有的gfp绿色荧光蛋白基因不能大量表达，所以我们在自然条件下所看到的菌落只是带有轻微的淡绿色。 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-ctricity, tobacco and other more efficient State, elecustomers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunicationsall branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan scope this document applies to24