氨基酸的分离鉴定纸层析法
实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法
【实验目的】
1. 学习氨基酸纸层析法的基本原理
2. 掌握氨基酸纸层析的操作技术
【实验原理】
层析分离技术是利用被分离的混合物中各组分物理化学的性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在两相(流动相和固定相)中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，从而达到分离。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2,3cm的某一处，该点称为原点;然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数(Kd)不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值(rate of flow, Rf)来
表
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示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点(又称为层析点)中心的距离(X)与原点至溶剂前沿的距离(Y)的比值:
物质的移动速率以 R f 值表示:
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
【器材与试剂】
(一)器材 1. 层析缸 2. 点样毛细管 3. 小烧杯 4. 培养皿 5. 量筒 6. 喷雾器 7. 吹风机(或烘箱)8. 层析滤纸(新华一号)9. 直尺及铅笔
(二) 试剂
1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液)
2. 氨基酸溶液 3. 显色剂:茚三酮溶液
【实验步骤】
1.准备滤纸:在纸的一端距边缘2,3?处用铅笔划一条直线，间隔2?作一记号。 2.点样:用毛细管将各氨基酸样品分别点在标记的位置上，点样时，毛细管口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在 0.3cm 之内。用吹风机稍加吹干后再点下一次,重复2,3次。 3.扩展:层析缸中加入30ml扩展剂，将缝成筒状的滤纸直立其中,采用上行法进行展层。当溶剂前沿上升到距纸上端 1 cm 时，取出滤纸，立即用铅笔记下溶剂前沿的位置，用吹风机吹干滤纸上的溶剂。用铅笔描出溶剂前沿界线，吹干。
4.显色:滤纸表面均匀喷上茚三酮溶液，切勿喷得过多致使斑点扩散。然后将滤纸用热风吹干或置烘箱中(100?)烘烤5min。
5.结果:用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的 R f 值，与标准氨基酸的 R f 值对照，确定混合物中含有哪些氨基酸。
计算:各种氨基酸的Rf值。
6.结果
分析
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注意事项 :
1 .点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。 2 .点样斑点不能太大(直径应小于 0 . 3 cm )，防止层析后氨基酸斑点过度扩散 和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。
3. 展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。
复习思考题、作业题:
1. 纸层析法的原理是什么,
2. 何谓Rf值,影响Rf值的主要因素是什么,
浙公网安备 33021202002483