沈同生化

第一章绪论 一、生物化学的的概念: 生物化学(biochemistry)是利用化学的原理与方法去探讨生命的一门科学,它是介于化学、生物学及物理学之间的一门边缘学科。 二、生物化学的发展: 1.叙述生物化学阶段:是生物化学发展的萌芽阶段,其主要的工作是 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 和研究生物体的组成成分以及生物体的分泌物和排泄物。 2.动态生物化学阶段:是生物化学蓬勃发展的时期。就在这一时期,人们基本上弄清了生物体内各种主要化学物质的代谢途径。 3.分子生物学阶段:这一阶段的主要研究工作就是探讨各种生物大分子的结构与其功能之间的关系。 三、生物化学研究的主要方面: 1.生物体的物质组成:高等生物体主要由蛋白质、核酸、糖类、脂类以及水、无机盐等组成,此外还含有一些低分子物质。 2.物质代谢:物质代谢的基本过程主要包括三大步骤:消化、吸收→中间代谢→排泄。其中,中间代谢过程是在细胞内进行的,最为复杂的化学变化过程,它包括合成代谢,分解代谢,物质互变,代谢调控,能量代谢几方面的内容。 3.细胞信号转导:细胞内存在多条信号转导途径,而这些途径之间通过一定的方式方式相互交织在一起,从而构成了非常复杂的信号转导网络,调控细胞的代谢、生理活动及生长分化。 4.生物分子的结构与功能:通过对生物大分子结构的理解,揭示结构与功能之间的关系。 5.遗传与繁殖:对生物体遗传与繁殖的分子机制的研究,也是现代生物化学与分子生物学研究的一个重要内容。 第二章蛋白质的结构与功能 一、氨基酸: 1.结构特点:氨基酸(amino acid)是蛋白质分子的基本组成单位。构成天然蛋白质分子的氨基酸约有20种,除脯氨酸为α-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外,其余氨基酸均为L-α-氨基酸。 2.分类:根据氨基酸的R基团的极性大小可将氨基酸分为四类:①非极性中性氨基酸(8种);②极性中性氨基酸(7种);③酸性氨基酸(Glu和Asp);④碱性氨基酸(Lys、Arg和His)。 二、肽键与肽链: 肽键(peptide bond)是指由一分子氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸的α-氨基经脱水而形成的共价键(-CO-NH-)。氨基酸分子在参与形成肽键之后,由于脱水而结构不完整,称为氨基酸残基。每条多肽链都有两端:即自由氨基端(N端)与自由羧基端(C端),肽链的方向是N端→C端。 三、肽键平面(肽单位): 肽键具有部分双键的性质,不能自由旋转;组成肽键的四个原子及其相邻的两个α碳原子处在同一个平面上,为刚性平面结构,称为肽键平面。 四、蛋白质的分子结构: 蛋白质的分子结构可人为分为一级、二级、三级和四级结构等层次。一级结构为线状结构,二、三、四级结构为空间结构。 1.一级结构:指多肽链中氨基酸的排列顺序,其维系键是肽键。蛋白质的一级结构决定其空间结构。 2.二级结构:指多肽链主链骨架盘绕折叠而形成的构象,借氢键维系。主要有以下几种类型: ⑴α-螺旋:其结构特征为:①主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋;②螺旋每上升一圈是3.6个氨基酸残基,螺距为0.54nm;③相邻螺旋圈之间形成许多氢键;④侧链基团位于螺旋的外侧。 影响α-螺旋形成的因素主要是:①存在侧链基团较大的氨基酸残基;②连续存在带相同电荷的氨基酸残基; ③存在脯氨酸残基。 ⑵β-折叠:其结构特征为:①若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片;②所有肽键的C=O和N—H形成链 间氢键;③侧链基团分别交替位于片层的上、下方。 ⑶β-转角:多肽链180°回折部分,通常由四个氨基酸残基构成,借1、4残基之间形成氢键维系。 ⑷无规卷曲:主链骨架无规律盘绕的部分。 3.三级结构:指多肽链所有原子的空间排布。其维系键主要是非共价键(次级键):氢键、疏水键、范德华力、离子键等,也可涉及二硫键。 4.四级结构:指亚基之间的立体排布、接触部位的布局等,其维系键为非共价键。亚基是指参与构成蛋白质四级结构的而又具有独立三级结构的多肽链。 五、蛋白质的理化性质: 1.两性解离与等电点:蛋白质分子中仍然存在游离的氨基和游离的羧基,因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质。蛋白质分子所带正、负电荷相等时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。 2.蛋白质的胶体性质:蛋白质具有亲水溶胶的性质。蛋白质分子 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。 3.蛋白质的紫外吸收:蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基对紫外光有吸收,以色氨酸吸收最强,最大吸收峰为280nm。 4.蛋白质的变性:蛋白质在某些理化因素的作用下,其特定的空间结构被破坏而导致其理化性质改变及生物活性丧失,这种现象称为蛋白质的变性。引起蛋白质变性的因素有:高温、高压、电离辐射、超声波、紫外线及有机溶剂、重金属盐、强酸强碱等。绝大多数蛋白质分子的变性是不可逆的。 六、蛋白质的分离与纯化: 1.盐析与有机溶剂沉淀:在蛋白质溶液中加入大量中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质从溶液中沉淀析出,称为盐析。常用的中性盐有:硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时,溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。凡能与水以任意比例混合的有机溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白质沉淀。 2.电泳:蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷,因此在电场中可以移动。电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小。 3.透析:利用透析袋膜的超滤性质,可将大分子物质与小分子物质分离开。 4.层析:利用混合物中各组分理化性质的差异,在相互接触的两相(固定相与流动相)之间的分布不同而进行分离。主要有离子交换层析,凝胶层析,吸附层析及亲和层析等,其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量。 5.超速离心:利用物质密度的不同,经超速离心后,分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量,蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。 七、氨基酸顺序分析: 蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析,即蛋白质一级结构的测定,主要有以下几个步骤: 1. 分离纯化蛋白质,得到一定量的蛋白质纯品; 2. 取一定量的样品进行完全水解,再测定蛋白质的氨基酸组成; 3. 分析蛋白质的N-端和C-端氨基酸; 4. 采用特异性的酶(如胰凝乳蛋白酶)或化学试剂(如溴化氰)将蛋白质处理为若干条肽段; 5. 分离纯化单一肽段; 6. 测定各条肽段的氨基酸顺序。一般采用Edman降解法,用异硫氰酸苯酯进行反应,将氨基酸降解后,逐一进行测定; 7. 至少用两种不同的方法处理蛋白质,分别得到其肽段的氨基酸顺序; 8. 将两套不同肽段的氨基酸顺序进行比较,以获得完整的蛋白质分子的氨基酸顺序。 第三章核酸的结构与功能 一、核酸的化学组成: 1.含氮碱:参与核酸和核苷酸构成的含氮碱主要分为嘌呤碱和嘧啶碱两大类。组成核苷酸的嘧啶碱主要有三种——尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T),它们都是嘧啶的衍生物。组成核苷酸的嘌呤碱主要有两种——腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),它们都是嘌呤的衍生物。 2.戊糖:核苷酸中的戊糖主要有两种,即β-D-核糖与β-D-2-脱氧核糖,由此构成的核苷酸也分为核糖核苷酸与脱氧核糖核酸两大类。 3.核苷:核苷是由戊糖与含氮碱基经脱水缩合而生成的化合物。通常是由核糖或脱氧核糖的C1’ β-羟基与嘧啶碱N1或嘌呤碱N9进行缩合,故生成的化学键称为β,N糖苷键。其中由D-核糖生成者称为核糖核苷,而由脱氧核糖生成者则称为脱氧核糖核苷。由“稀有碱基”所生成的核苷称为“稀有核苷”。假尿苷(ψ)就是由D-核糖的C1’ 与尿嘧啶的C5相连而生成的核苷。 二、核苷酸的结构与命名: 核苷酸是由核苷与磷酸经脱水缩合后生成的磷酸酯类化合物,包括核糖核苷酸和脱氧核糖核酸两大类。最常见的核苷酸为5’-核苷酸(5’ 常被省略)。5’-核苷酸又可按其在5’位缩合的磷酸基的多少,分为一磷酸核苷(核苷酸)、二磷酸核苷和三磷酸核苷。 此外,生物体内还存在一些特殊的环核苷酸,常见的为环一磷酸腺苷(cAMP)和环一磷酸鸟苷(cGMP),它们通常是作为激素作用的第二信使。 核苷酸通常使用缩写符号进行命名。第一位符号用小写字母d代表脱氧,第二位用大写字母代表碱基,第三位用大写字母代表磷酸基的数目,第四位用大写字母P代表磷酸。 三、核酸的一级结构: 核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的多核苷酸长链化合物就称为核酸。核酸具有方向性,5’-位上具有自由磷酸基的末端称为5’-端,3’-位上具有自由羟基的末端称为3’-端。 DNA由dAMP、dGMP、dCMP和dTMP四种脱氧核糖核苷酸所组成。DNA的一级结构就是指DNA分子中脱氧核糖核苷酸的种类、数目、排列顺序及连接方式。RNA由AMP,GMP,CMP,UMP四种核糖核苷酸组成。RNA的一级结构就是指RNA分子中核糖核苷酸的种类、数目、排列顺序及连接方式。 四、DNA的二级结构: DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式,它是Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型,其主要实验依据是Chargaff研究小组对DNA的化学组成进行的分析研究,即DNA分子中四种碱基的摩尔百分比为A=T、G=C、A+G=T+C(Chargaff原则),以及由Wilkins研究小组完成的DNA晶体X线衍射图谱分析。 天然DNA的二级结构以B型为主,其结构特征为:①为右手双螺旋,两条链以反平行方式排列;②主链位于螺旋外侧,碱基位于内侧;③两条链间存在碱基互补,通过氢键连系,且A-T、G-C(碱基互补原则);④螺旋的稳定因素为氢键和碱基堆砌力;⑤螺旋的螺距为3.4nm,直径为2nm。 五、DNA的超螺旋结构: 双螺旋的DNA分子进一步盘旋形成的超螺旋结构称为DNA的三级结构。 绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋,其三级结构呈麻花状。 在真核生物中,双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕,从而形成特殊的串珠状结构,称为核小体。核小体结构属于DNA的三级结构。 六、DNA的功能: DNA的基本功能是作为遗传信息的载体,为生物遗传信息复制以及基因信息的转录提供 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 。 DNA分子中具有特定生物学功能的片段称为基因(gene)。一个生物体的全部DNA序列称为基因组(genome)。基因组的大小与生物的复杂性有关。 七、RNA的空间结构与功能: RNA分子的种类较多,分子大小变化较大,功能多样化。RNA通常以单链存在,但也可形成局部的双螺旋结构。 1.mRNA的结构与功能:mRNA是单链核酸,其在真核生物中的初级产物称为HnRNA。大多数真核成熟的mRNA分子具有典型的5’-端的7-甲基鸟苷三磷酸(m7GTP)帽子结构和3’-端的多聚腺苷酸(polyA)尾巴结构。mRNA的功能是为蛋白质的合成提供模板,分子中带有遗传密码。mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组,在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸,这种核苷酸三联体称为遗传密码(coden)。 2.tRNA的结构与功能:tRNA是分子最小,但含有稀有碱基最多的RNA。tRNA的二级结构由于局部双螺旋的形成而表现为“三叶草”形,故称为“三叶草”结构,可分为五个部分:①氨基酸臂:由tRNA的5’-端和3’-端构成的局部双螺旋,3’-端都带有-CCA-OH顺序,可与氨基酸结合而携带氨基酸。②DHU臂:含有二氢尿嘧啶核苷,与氨基酰tRNA合成酶的结合有关。③反密码臂:其反密码环中部的三个核苷酸组成三联体,在蛋白质生物合成中,可以用来识别mRNA上相应的密码,故称为反密码(anticoden)。④TψC臂:含保守的TψC顺序,可以识别核蛋白体上的rRNA,促使tRNA与核蛋白体结合。⑤可变臂:位于TψC臂和反密码臂之间,功能不详。 3.rRNA的结构与功能:rRNA是细胞中含量最多的RNA,可与蛋白质一起构成核蛋白体,作为蛋白质生物合成的场所。原核生物中的rRNA有三种:5S,16S,23S。真核生物中的rRNA有四种:5S,5.8S,18S,28S。 八、核酶: 具有自身催化作用的RNA称为核酶(ribozyme),核酶通常具有特殊的分子结构,如锤头结构。 九、核酸的一般理化性质: 核酸具有酸性;粘度大;能吸收紫外光,最大吸收峰为260nm。 十、DNA的变性: 在理化因素作用下,DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链,从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变,这种现象称为DNA的变性。 引起DNA变性的因素主要有:①高温,②强酸强碱,③有机溶剂等。DNA变性后的性质改变:①增色效应:指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象;②旋光性下降;③粘度降低;④生物功能丧失或改变。加热DNA溶液,使其对260nm紫外光的吸收度突然增加,达到其最大值一半时的温度,就是DNA的变性温度(融解温度,Tm)。Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关,G+C的含量越高,则Tm越高。 十一、DNA的复性与分子杂交: 将变性DNA经退火处理,使其重新形成双螺旋结构的过程,称为DNA的复性。 两条来源不同的单链核酸(DNA或RNA),只要它们有大致相同的互补碱基顺序,以退火处理即可复性,形成新的杂种双螺旋,这一现象称为核酸的分子杂交。核酸杂交可以是DNA-DNA,也可以是DNA-RNA杂交。不同来源的,具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。 常用的核酸分子杂交技术有:原位杂交、斑点杂交、Southern杂交及Northern杂交等。 在核酸杂交分析过程中,常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记,这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。 十二、核酸酶: 凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶。凡能从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶,凡能从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶。能识别特定的核苷酸顺序,并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶(限制酶)。 第四章酶 一、酶的概念: 酶(enzyme)是由活细胞产生的生物催化剂,这种催化剂具有极高的催化效率和高度的底物特异性,其化学本质是蛋白质。酶按照其分子结构可分为单体酶、寡聚酶和多酶体系(多酶复合体和多功能酶)三大类。 二、酶的分子组成: 酶分子可根据其化学组成的不同,可分为单纯酶和结合酶(全酶)两类。结合酶则是由酶蛋白和辅助因子两部分构成,酶蛋白部分主要与酶的底物特异性有关,辅助因子则与酶的催化活性有关。 与酶蛋白疏松结合并与酶的催化活性有关的耐热低分子有机化合物称为辅酶。与酶蛋白牢固结合并与酶的催化活性有关的耐热低分子有机化合物称为辅基。 三、辅酶与辅基的来源及其生理功用: 辅酶与辅基的生理功用主要是:⑴运载氢原子或电子,参与氧化还原反应。⑵运载反应基团,如酰基、氨基、烷基、羧基及一碳单位等,参与基团转移。大部分的辅酶与辅基衍生于维生素。 维生素(vitamin)是指一类维持细胞正常功能所必需的,但在许多生物体内不能自身合成而必须由食物供给的小分子有机化合物。 维生素可按其溶解性的不同分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类。脂溶性维生素有VitA、VitD、VitE和VitK四种;水溶性维生素有VitB1,VitB2,VitPP,VitB6,VitB12,VitC,泛酸,生物素,叶酸等。 1.TPP:即焦磷酸硫胺素,由硫胺素(Vit B1)焦磷酸化而生成,是脱羧酶的辅酶,在体内参与糖代谢过程中α-酮酸的氧化脱羧反应。 2.FMN和FAD:即黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),是核黄素(VitB2)的衍生物。FMN 或FAD通常作为脱氢酶的辅基,在酶促反应中作为递氢体(双递氢体)。 3.NAD+和NADP+:即尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+,辅酶Ⅰ)和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+,辅酶Ⅱ),是Vit PP的衍生物。NAD+和NADP+主要作为脱氢酶的辅酶,在酶促反应中起递氢体的作用,为单递氢体。 4.磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺:是Vit B6的衍生物。磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺可作为氨基转移酶,氨基酸脱羧酶,半胱氨酸脱硫酶等的辅酶。 5.CoA:泛酸(遍多酸)在体内参与构成辅酶A(CoA)。CoA中的巯基可与羧基以高能硫酯键结合,在糖、脂、蛋白质代谢中起传递酰基的作用,是酰化酶的辅酶。 6.生物素:是羧化酶的辅基,在体内参与CO2的固定和羧化反应。 7. FH4:由叶酸衍生而来。四氢叶酸是体内一碳单位基团转移酶系统中的辅酶。 8. Vit B12衍生物:Vit B12分子中含金属元素钴,故又称为钴胺素。Vit B12在体内有多种活性形式,如5'-脱氧腺苷钴胺素、甲基钴胺素等。其中,5'-脱氧腺苷钴胺素参与构成变位酶的辅酶,甲基钴胺素则是甲基转移酶的辅酶。 四、金属离子的作用: 1. 稳定构象:稳定酶蛋白催化活性所必需的分子构象; 2. 构成酶的活性中心:作为酶的活性中心的组成成分,参与构成酶的活性中心; 3. 连接作用:作为桥梁,将底物分子与酶蛋白螯合起来。 五、酶的活性中心: 酶分子上具有一定空间构象的部位,该部位化学基团集中,直接参与将底物转变为产物的反应过程,这一部位就称为酶的活性中心。 参与构成酶的活性中心的化学基团,有些是与底物相结合的,称为结合基团,有些是催化底物反应转变成产物的,称为催化基团,这两类基团统称为活性中心内必需基团。在酶的活性中心以外,也存在一些化学基团,主要与维系酶的空间构象有关,称为酶活性中心外必需基团。 六、酶促反应的特点: 1.具有极高的催化效率:酶的催化效率可比一般催化剂高106~1020倍。酶能与底物形成ES中间复合物,从而改变化学反应的进程,使反应所需活化能阈大大降低,活化分子的数目大大增加,从而加速反应进行。 2.具有高度的底物特异性:一种酶只作用于一种或一类化合物,以促进一定的化学变化,生成一定的产物,这种现象称为酶作用的特异性。 ⑴绝对特异性:一种酶只能作用于一种化合物,以催化一种化学反应,称为绝对特异性,如琥珀酸脱氢酶。 ⑵相对特异性:一种酶只能作用于一类化合物或一种化学键,催化一类化学反应,称为相对特异性,如脂肪酶。 ⑶立体异构特异性:一种酶只能作用于一种立体异构体,或只能生成一种立体异构体,称为立体异构特异性,如L-精氨酸酶。 3.酶的催化活性是可以调节的:如代谢物可调节酶的催化活性,对酶分子的共价修饰可改变酶的催化活性,也可通过改变酶蛋白的合成来改变其催化活性。 七、酶促反应的机制: 1.中间复合物学说与诱导契合学说:酶催化时,酶活性中心首先与底物结合生成一种酶-底物复合物(ES),此复合物再分解释放出酶,并生成产物,即为中间复合物学说。当底物与酶接近时,底物分子可以诱导酶活性 中心的构象以生改变,使之成为能与底物分子密切结合的构象,这就是诱导契合学说。 2.与酶的高效率催化有关的因素:①趋近效应与定向作用;②张力作用;③酸碱催化作用;④共价催化作用; ⑤酶活性中心的低介电区(表面效应)。 八、酶促反应动力学: 酶反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素。在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时,通常测定其初始速度来代表酶促反应速度,即底物转化量<5%时的反应速度。 1.底物浓度对反应速度的影响: ⑴底物对酶促反应的饱和现象:由实验观察到,在酶浓度不变时,不同的底物浓度与反应速度的关系为一矩形双曲线,即当底物浓度较低时,反应速度的增加与底物浓度的增加成正比(一级反应);此后,随底物浓度的增加,反应速度的增加量逐渐减少(混合级反应);最后,当底物浓度增加到一定量时,反应速度达到一最大值,不再随底物浓度的增加而增加(零级反应)。 ⑵米氏方程及米氏常数:根据上述实验结果,Michaelis & Menten 于1913年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式,即米氏方程:ν= Vmax[S]/(Km+[S])。其中,Vmax为最大反应速度,Km为米氏常数。 ⑶Km和Vmax的意义: ①当ν=Vmax/2时,Km=[S]。因此,Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。 ②当k-1>>k+2时,Km=k-1/k+1=Ks。因此,Km可以反映酶与底物亲和力的大小,即Km值越小,则酶与底物的亲和力越大;反之,则越小。 ③Km可用于判断反应级数:当[S]<0.01Km时,ν=(Vmax/Km)[S],反应为一级反应,即反应速度与底物浓度成正比;当[S]>100Km时,ν=Vmax,反应为零级反应,即反应速度与底物浓度无关;当0.01Km<[S]<100Km 时,反应处于零级反应和一级反应之间,为混合级反应。 ④Km是酶的特征性常数:在一定条件下,某种酶的Km值是恒定的,因而可以通过测定不同酶(特别是一组同工酶)的Km值,来判断是否为不同的酶。 ⑤Km可用来判断酶的最适底物:当酶有几种不同的底物存在时,Km值最小者,为该酶的最适底物。 ⑥Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度:当[S]=10Km时,ν=91%Vmax,为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。 ⑦Vmax可用于酶的转换数的计算:当酶的总浓度和最大速度已知时,可计算出酶的转换数,即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。 ⑷Km和Vmax的测定:主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法和Hanes作图法。 2.酶浓度对反应速度的影响:当反应系统中底物的浓度足够大时,酶促反应速度与酶浓度成正比,即ν=k[E]。 3.温度对反应速度的影响:一般来说,酶促反应速度随温度的增高而加快,但当温度增加达到某一点后,由于酶蛋白的热变性作用,反应速度迅速下降。酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时的温度就称为酶的最适温度。酶的最适温度与实验条件有关,因而它不是酶的特征性常数。低温时由于活化分子数目减少,反应速度降低,但温度升高后,酶活性又可恢复。 4.pH对反应速度的影响:观察pH对酶促反应速度的影响,通常为一钟形曲线,即pH过高或过低均可导致酶催化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的pH值就称为酶的最适pH。人体内大多数酶的最适pH在6.5~8.0之间。酶的最适pH不是酶的特征性常数。 5.抑制剂对反应速度的影响: 凡是能降低酶促反应速度,但不引起酶分子变性失活的物质统称为酶的抑制剂。按照抑制剂的抑制作用,可将其分为不可逆抑制作用和可逆抑制作用两大类。 ⑴不可逆抑制作用: 抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制,且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。如果以ν~[E]作图,就可得到一组斜率相同的平行线,随抑制剂浓度的增加而平行向右移动。酶的不可逆抑制作用包括专一性抑制(如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制)和非专一性抑制(如路易斯气对巯基酶的抑制)两种。 ⑵可逆抑制作用: 抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制,且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制作用就是可逆抑制作用。如果以ν~[E]作图,可得到一组随抑制剂浓度增加而斜率降低的直线。可逆抑制作用包括竞争性、反竞争性和非竞争性抑制几种类型。 ①竞争性抑制:抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合,从而干扰了酶与底物的结合,使酶的催化活性降低,这种作用就称为竞争性抑制作用。其特点为:a.竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物;b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同;c.抑制剂浓度越大,则抑制作用越大;但增加底物浓度可使抑制程度减小;d.动力学参数:Km值增大,Vm值不变。典型的例子是丙二酸对琥珀酸脱氢酶(底物为琥珀酸)的竞争性抑制和磺胺类药物(对氨基苯磺酰胺)对二氢叶酸合成酶(底物为对氨基苯甲酸)的竞争性抑制。 ②反竞争性抑制:抑制剂不能与游离酶结合,但可与ES复合物结合并阻止产物生成,使酶的催化活性降低,称酶的反竞争性抑制。其特点为:a.抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合;b.必须有底物存在,抑制剂才能对酶产生抑制作用;c.动力学参数:Km减小,Vm降低。 ③非竞争性抑制:抑制剂既可以与游离酶结合,也可以与ES复合物结合,使酶的催化活性降低,称为非竞争性抑制。其特点为:a.底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合;b.抑制剂对酶与底物的结合无影响,故底物浓度的改变对抑制程度无影响;c.动力学参数:Km值不变,Vm值降低。 6.激活剂对反应速度的影响:能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。酶的激活剂大多数是金属离子,如K+、Mg2+、Mn2+等,唾液淀粉酶的激活剂为Cl-。 九、酶的调节: 可以通过改变其催化活性而使整个代谢反应的速度或方向发生改变的酶就称为限速酶或关键酶。 酶活性的调节可以通过改变其结构而使其催化活性以生改变,也可以通过改变其含量来改变其催化活性,还可以通过以不同形式的酶在不同组织中的分布差异来调节代谢活动。 1.酶结构的调节:通过对现有酶分子结构的影响来改变酶的催化活性。这是一种快速调节方式。 ⑴变构调节:又称别构调节。某些代谢物能与变构酶分子上的变构部位特异性结合,使酶的分子构发生改变,从而改变酶的催化活性以及代谢反应的速度,这种调节作用就称为变构调节。具有变构调节作用的酶就称为变构酶。凡能使酶分子变构并使酶的催化活性发生改变的代谢物就称为变构剂。当变构酶的一个亚基与其配体(底物或变构剂)结合后,能够通过改变相邻亚基的构象而使其对配体的亲和力发生改变,这种效应就称为变构酶的协同效应。变构剂一般以反馈方式对代谢途径的起始关键酶进行调节,常见的为负反馈调节。变构调节的特点:①酶活性的改变通过酶分子构象的改变而实现;②酶的变构仅涉及非共价键的变化;③调节酶活性的因素为代谢物;④为一非耗能过程;⑤无放大效应。 ⑵共价修饰调节:酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化下发生共价修饰,从而导致酶活性的改变,称为共价修饰调节。共价修饰方式有:磷酸化-脱磷酸化等。共价修饰调节一般与激素的调节相联系,其调节方式为级联反应。共价修饰调节的特点为:①酶以两种不同修饰和不同活性的形式存在;②有共价键的变化;③受其他调节因素(如激素)的影响;④一般为耗能过程;⑤存在放大效应。 ⑶酶原的激活:处于无活性状态的酶的前身物质就称为酶原。酶原在一定条件下转化为有活性的酶的过程称为酶原的激活。酶原的激活过程通常伴有酶蛋白一级结构的改变。酶原分子一级结构的改变导致了酶原分子空间结构的改变,使催化活性中心得以形成,故使其从无活性的酶原形式转变为有活性的酶。酶原激活的生理意义在于:保护自身组织细胞不被酶水解消化。 2.酶含量的调节:是指通过改变细胞中酶蛋白合成或降解的速度来调节酶分子的绝对含量,影响其催化活性,从而调节代谢反应的速度。这是机体内迟缓调节的重要方式。 ⑴酶蛋白合成的调节:酶蛋白的合成速度通常通过一些诱导剂或阻遏剂来进行调节。凡能促使基因转录增强,从而使酶蛋白合成增加的物质就称为诱导剂;反之,则称为阻遏剂。常见的诱导剂或阻遏剂包括代谢物、药物和激素等。 ⑵酶蛋白降解的调节:如饥饿时,精氨酸酶降解减慢,故酶活性增高,有利于氨基酸的分解供能。 3.同工酶的调节:在同一种属中,催化活性相同而酶蛋白的分子结构,理化性质及免疫学性质不同的一组酶 称为同工酶。同工酶在体内的生理意义主要在于适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要。因此,同工酶在体内的生理功能是不同的。 乳酸脱氢酶同工酶(LDHs)为四聚体,在体内共有五种分子形式,即LDH1(H4),LDH2(H3M1),LDH3(H2M2), LDH4(H1M3)和LDH5(M4)。心肌中以LDH1含量最多,LDH1对乳酸的亲和力较高,因此它的主要作用是催化乳酸转变为丙酮酸再进一步氧化分解,以供应心肌的能量。在骨骼肌中含量最多的是LDH5,LDH5对丙酮酸的亲和力较高,因此它的主要作用是催化丙酮酸转变为乳酸,以促进糖酵解的进行。 十、酶的命名与分类: 1.酶的命名:主要有习惯命名法与系统命名法两种,但常用者为习惯命名法。 2.酶的分类:根据1961年国际酶学委员会(IEC)的分类法,将酶分为六大类:①氧化还原酶类:催化氧化还原反应;②转移酶类:催化一个基团从某种化合物至另一种化合物;③水解酶类:催化化合物的水解反应; ④裂合酶类:催化从双键上去掉一个基团或加上一个基团至双键上;⑤异构酶类:催化分子内基团重排;⑥合成酶类:催化两分子化合物的缔合反应。 第五章糖代谢 一、糖类的生理功用: ①氧化供能:糖类是人体最主要的供能物质,占全部供能物质供能量的70%;与供能有关的糖类主要是葡萄糖和糖原,前者为运输和供能形式,后者为贮存形式。②作为结构成分:糖类可与脂类形成糖脂,或与蛋白质形成糖蛋白,糖脂和糖蛋白均可参与构成生物膜、神经组织等。③作为核酸类化合物的成分:核糖和脱氧核糖参与构成核苷酸,DNA,RNA等。④转变为其他物质:糖类可经代谢而转变为脂肪或氨基酸等化合物。二、糖的无氧酵解: 糖的无氧酵解是指葡萄糖在无氧条件下分解生成乳酸并释放出能量的过程。其全部反应过程在胞液中进行,代谢的终产物为乳酸,一分子葡萄糖经无氧酵解可净生成两分子ATP。 糖的无氧酵解代谢过程可分为四个阶段: 1. 活化(己糖磷酸酯的生成):葡萄糖经磷酸化和异构反应生成1,6-双磷酸果糖(FBP),即葡萄糖→6-磷酸葡萄糖→6-磷酸果糖→1,6-双磷酸果糖(F-1,6-BP)。这一阶段需消耗两分子ATP,己糖激酶(肝中为葡萄糖激酶)和6-磷酸果糖激酶-1是关键酶。 2. 裂解(磷酸丙糖的生成):一分子F-1,6-BP裂解为两分子3-磷酸甘油醛,包括两步反应:F-1,6-BP→磷酸二羟丙酮+ 3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮→3-磷酸甘油醛。 3. 放能(丙酮酸的生成):3-磷酸甘油醛经脱氢、磷酸化、脱水及放能等反应生成丙酮酸,包括五步反应:3-磷酸甘油醛→1,3-二磷酸甘油酸→3-磷酸甘油酸→2-磷酸甘油酸→磷酸烯醇式丙酮酸→丙酮酸。此阶段有两次底物水平磷酸化的放能反应,共可生成2×2=4分子ATP。丙酮酸激酶为关键酶。 4.还原(乳酸的生成):利用丙酮酸接受酵解代谢过程中产生的NADH,使NADH重新氧化为NAD+。即丙酮酸→乳酸。 三、糖无氧酵解的调节: 主要是对三个关键酶,即己糖激酶(葡萄糖激酶)、6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶进行调节。己糖激酶的变构抑制剂是G-6-P;肝中的葡萄糖激酶是调节肝细胞对葡萄糖吸收的主要因素,受长链脂酰CoA的反馈抑制;6-磷酸果糖激酶-1是调节糖酵解代谢途径流量的主要因素,受A TP和柠檬酸的变构抑制,AMP、ADP、1,6-双磷酸果糖和2,6-双磷酸果糖的变构激活;丙酮酸激酶受1,6-双磷酸果糖的变构激活,受ATP的变构抑制,肝中还受到丙氨酸的变构抑制。 四、糖无氧酵解的生理意义: 1. 在无氧和缺氧条件下,作为糖分解供能的补充途径:⑴骨骼肌在剧烈运动时的相对缺氧;⑵从平原进入高原初期;⑶严重贫血、大量失血、呼吸障碍、肺及心血管疾患所致缺氧。 2. 在有氧条件下,作为某些组织细胞主要的供能途径:如表皮细胞,红细胞及视网膜等,由于无线粒体,故只能通过无氧酵解供能。 五、糖的有氧氧化: 葡萄糖在有氧条件下彻底氧化分解生成C2O和H2O,并释放出大量能量的过程称为糖的有氧氧化。绝大多数组织细胞通过糖的有氧氧化途径获得能量。此代谢过程在细胞胞液和线粒体内进行,一分子葡萄糖彻底氧化分解可产生36/38分子ATP。糖的有氧氧化代谢途径可分为三个阶段: 1.葡萄糖经酵解途径生成丙酮酸: 此阶段在细胞胞液中进行,与糖的无氧酵解途径相同,涉及的关键酶也相同。一分子葡萄糖分解后生成两分子丙酮酸,两分子(NADH+H+)并净生成2分子ATP。NADH在有氧条件下可进入线粒体产能,共可得到2×2或2×3分子ATP。故第一阶段可净生成6/8分子ATP。 2.丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA: 丙酮酸进入线粒体,在丙酮酸脱氢酶系的催化下氧化脱羧生成(NADH+H+)和乙酰CoA。此阶段可由两分子(NADH+H+) 产生2×3分子ATP 。丙酮酸脱氢酶系为关键酶,该酶由三种酶单体构成,涉及六种辅助因子,即NAD+、FAD、CoA、TPP、硫辛酸和Mg2+。 3.经三羧酸循环彻底氧化分解: 生成的乙酰CoA可进入三羧酸循环彻底氧化分解为CO2和H2O,并释放能量合成ATP。一分子乙酰CoA氧化分解后共可生成12分子A TP,故此阶段可生成2×12=24分子ATP。 三羧酸循环是指在线粒体中,乙酰CoA首先与草酰乙酸缩合生成柠檬酸,然后经过一系列的代谢反应,乙酰基被氧化分解,而草酰乙酸再生的循环反应过程。这一循环反应过程又称为柠檬酸循环或Krebs循环。 三羧酸循环由八步反应构成:草酰乙酸+ 乙酰CoA→柠檬酸→异柠檬酸→α-酮戊二酸→琥珀酰CoA→琥珀酸→延胡索酸→苹果酸→草酰乙酸。 三羧酸循环的特点:①循环反应在线粒体中进行,为不可逆反应。②每完成一次循环,氧化分解掉一分子乙酰基,可生成12分子ATP。③循环的中间产物既不能通过此循环反应生成,也不被此循环反应所消耗。④循环中有两次脱羧反应,生成两分子CO2。⑤循环中有四次脱氢反应,生成三分子NADH和一分子FADH2。 ⑥循环中有一次直接产能反应,生成一分子GTP。⑦三羧酸循环的关键酶是柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶系,且α-酮戊二酸脱氢酶系的结构与丙酮酸脱氢酶系相似,辅助因子完全相同。 六、糖有氧氧化的生理意义: 1.是糖在体内分解供能的主要途径:⑴生成的A TP数目远远多于糖的无氧酵解生成的ATP数目;⑵机体内大多数组织细胞均通过此途径氧化供能。 2.是糖、脂、蛋白质氧化供能的共同途径:糖、脂、蛋白质的分解产物主要经此途径彻底氧化分解供能。 3.是糖、脂、蛋白质相互转变的枢纽:有氧氧化途径中的中间代谢物可以由糖、脂、蛋白质分解产生,某些中间代谢物也可以由此途径逆行而相互转变。 七、有氧氧化的调节和巴斯德效应: 丙酮酸脱氢酶系受乙酰CoA、A TP和NADH的变构抑制,受AMP、ADP和NAD+的变构激活。异柠檬酸脱氢酶是调节三羧酸循环流量的主要因素,A TP是其变构抑制剂,AMP和ADP是其变构激活剂。 巴斯德效应:糖的有氧氧化可以抑制糖的无氧酵解的现象。有氧时,由于酵解产生的NADH和丙酮酸进入线粒体而产能,故糖的无氧酵解受抑制。 八、磷酸戊糖途径: 磷酸戊糖途径是指从G-6-P脱氢反应开始,经一系列代谢反应生成磷酸戊糖等中间代谢物,然后再重新进入糖氧化分解代谢途径的一条旁路代谢途径。该旁路途径的起始物是G-6-P,返回的代谢产物是3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖,其重要的中间代谢产物是5-磷酸核糖和NADPH。整个代谢途径在胞液中进行。关键酶是6-磷酸葡萄糖脱氢酶。 九、磷酸戊糖途径的生理意义: 1. 是体内生成NADPH的主要代谢途径:NADPH在体内可用于:⑴作为供氢体,参与体内的合成代谢: 如参与合成脂肪酸、胆固醇等。⑵参与羟化反应:作为加单氧酶的辅酶,参与对代谢物的羟化。⑶维持巯基酶的活性。⑷使氧化型谷胱甘肽还原。⑸维持红细胞膜的完整性:由于6-磷酸葡萄糖脱氢酶遗传性缺陷可导 致蚕豆病,表现为溶血性贫血。 2. 是体内生成5-磷酸核糖的唯一代谢途径:体内合成核苷酸和核酸所需的核糖或脱氧核糖均以5-磷酸核糖的形式提供,其生成方式可以由G-6-P脱氢脱羧生成,也可以由3-磷酸甘油醛和F-6-P经基团转移的逆反应生成。 十、糖原的合成与分解: 糖原是由许多葡萄糖分子聚合而成的带有分支的高分子多糖类化合物。糖原分子的直链部分借α-1,4-糖苷键而将葡萄糖残基连接起来,其支链部分则是借α-1,6-糖苷键而形成分支。糖原是一种无还原性的多糖。糖原的合成与分解代谢主要发生在肝、肾和肌肉组织细胞的胞液中。 1.糖原的合成代谢:糖原合成的反应过程可分为三个阶段。 ⑴活化:由葡萄糖生成尿苷二磷酸葡萄糖:葡萄糖→6-磷酸葡萄糖→1-磷酸葡萄糖→UDPG。此阶段需使用UTP,并消耗相当于两分子的ATP。 ⑵缩合:在糖原合酶催化下,UDPG所带的葡萄糖残基通过α-1,4-糖苷键与原有糖原分子的非还原端相连,使糖链延长。糖原合酶是糖原合成的关键酶。 ⑶分支:当直链长度达12个葡萄糖残基以上时,在分支酶的催化下,将距末端6~7个葡萄糖残基组成的寡糖链由α-1,4-糖苷键转变为α-1,6-糖苷键,使糖原出现分支,同时非还原端增加。 2.糖原的分解代谢:糖原的分解代谢可分为三个阶段,是一非耗能过程。 ⑴水解:糖原→1-磷酸葡萄糖。此阶段的关键酶是糖原磷酸化酶,并需脱支酶协助。 ⑵异构:1-磷酸葡萄糖→6-磷酸葡萄糖。 ⑶脱磷酸:6-磷酸葡萄糖→葡萄糖。此过程只能在肝和肾进行。 十一、糖原合成与分解的生理意义: 1.贮存能量:葡萄糖可以糖原的形式贮存。 2.调节血糖浓度:血糖浓度高时可合成糖原,浓度低时可分解糖原来补充血糖。 3.利用乳酸:肝中可经糖异生途径利用糖无氧酵解产生的乳酸来合成糖原。这就是肝糖原合成的三碳途径或间接途径。 十二、糖异生: 由非糖物质转变为葡萄糖或糖原的过程称为糖异生。该代谢途径主要存在于肝及肾中。糖异生主要沿酵解途径逆行,但由于有三步反应(己糖激酶、磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶)为不可逆反应,故需经另外的反应绕行。 1.G-6-P → G:由葡萄糖-6-磷酸酶催化进行水解,该酶是糖异生的关键酶之一,不存在于肌肉组织中,故肌肉组织不能生成自由葡萄糖。 2.F-1,6-BP → F-6-P:由果糖1,6-二磷酸酶-1催化进行水解,该酶也是糖异生的关键酶之一。 3.丙酮酸→ 磷酸烯醇式丙酮酸:经由丙酮酸羧化支路完成,即丙酮酸进入线粒体,在丙酮酸羧化酶(需生物素)的催化下生成草酰乙酸,后者转变为苹果酸穿出线粒体并回复为草酰乙酸,再在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的催化下转变为磷酸烯醇式丙酮酸,这两个酶都是关键酶。 糖异生的原料主要来自于生糖氨基酸、甘油和乳酸。 十三、糖异生的生理意义: 1.在饥饿情况下维持血糖浓度的相对恒定:在较长时间饥饿的情况下,机体需要靠糖异生作用生成葡萄糖以维持血糖浓度的相对恒定。 2.回收乳酸分子中的能量:由于乳酸主要是在肌肉组织经糖的无氧酵解产生,但肌肉组织糖异生作用很弱,且不能生成自由葡萄糖,故需将产生的乳酸转运至肝脏重新生成葡萄糖后再加以利用。 葡萄糖在肌肉组织中经糖的无氧酵解产生的乳酸,可经血循环转运至肝脏,再经糖的异生作用生成自由葡萄糖后转运至肌肉组织加以利用,这一循环过程就称为乳酸循环(Cori循环)。 3.维持酸碱平衡:肾脏中生成的α-酮戊二酸可转变为草酰乙酸,然后经糖异生途径生成葡萄糖,这一过程可促进肾脏中的谷氨酰胺脱氨基,生成NH3,后者可用于中和H+,故有利于维持酸碱平衡。 十四、血糖: 血液中的葡萄糖含量称为血糖。按真糖法测定,正常空腹血糖浓度为3.89~6.11mmol/L(70~100mg%)。 1.血糖的来源与去路:正常情况下,血糖浓度的相对恒定是由其来源与去路两方面的动态平衡所决定的。血糖的主要来源有:①消化吸收的葡萄糖;②肝脏的糖异生作用;③肝糖原的分解。血糖的主要去路有:①氧化分解供能;②合成糖原(肝、肌、肾);③转变为脂肪或氨基酸;④转变为其他糖类物质。 2.血糖水平的调节:调节血糖浓度相对恒定的机制有: ⑴组织器官:①肝脏:通过加快将血中的葡萄糖转运入肝细胞,以及通过促进肝糖原的合成,以降低血糖浓度;通过促进肝糖原的分解,以及促进糖的异生作用,以增高血糖浓度。②肌肉等外周组织:通过促进其对葡萄糖的氧化利用以降低血糖浓度。 ⑵激素:①降低血糖浓度的激素——胰岛素。②升高血糖浓度的激素——胰高血糖素、肾上腺素、糖皮质激素、生长激素、甲状腺激素。 ⑶神经系统。 第六章脂类代谢 一、脂类的分类和生理功用: 脂类是脂肪和类脂的总称,是一大类不溶于水而易溶于有机溶剂的化合物。其中,脂肪主要是指甘油三酯,类脂则包括磷脂(甘油磷脂和鞘磷脂)、糖脂(脑苷脂和神经节苷脂)、胆固醇及胆固醇酯。 脂类物质具有下列生理功用:①供能贮能:主要是甘油三酯具有此功用,体内20%~30%的能量由甘油三酯提供。②构成生物膜:主要是磷脂和胆固醇具有此功用。③协助脂溶性维生素的吸收,提供必需脂肪酸。必需脂肪酸是指机体需要,但自身不能合成,必须要靠食物提供的一些多烯脂肪酸。④保护和保温作用:大网膜和皮下脂肪具有此功用。 二、甘油三酯的分解代谢: 1.脂肪动员:贮存于脂肪细胞中的甘油三酯在激素敏感脂肪酶的催化下水解并释放出脂肪酸,供给全身各组织细胞摄取利用的过程称为脂肪动员。激素敏感脂肪酶(HSL)是脂肪动员的关键酶。HSL的激活剂是肾上腺素、去甲肾上腺素和胰高血糖素;抑制剂是胰岛素、前列腺素E2和烟酸。 脂肪动员的过程为:激素+膜受体→腺苷酸环化酶↑→cAMP↑→蛋白激酶↑→激素敏感脂肪酶(HSL,甘油三酯酶)↑→甘油三酯分解↑。 脂肪动员的结果是生成三分子的自由脂肪酸(FFA)和一分子的甘油。脂肪酸进入血液循环后须与清蛋白结合成为复合体再转运,甘油则转运至肝脏再磷酸化为3-磷酸甘油后进行代谢。 2.脂肪酸的β氧化:体内大多数的组织细胞均可以此途径氧化利用脂肪酸。其代谢反应过程可分为三个阶段: (1) 活化:在线粒体外膜或内质网进行此反应过程。由脂肪酸硫激酶(脂酰CoA合成酶)催化生成脂酰CoA。每活化一分子脂肪酸,需消耗两分子A TP。 (2) 进入:借助于两种肉碱脂肪酰转移酶(酶Ⅰ和酶Ⅱ)催化的移换反应,脂酰CoA由肉碱(肉毒碱)携带进入线粒体。肉碱脂肪酰转移酶Ⅰ是脂肪酸β-氧化的关键酶。 ⑶β-氧化:由四个连续的酶促反应组成:①脱氢:脂肪酰CoA在脂肪酰CoA脱氢酶的催化下,生成FADH2和α,β-烯脂肪酰CoA。②水化:在水化酶的催化下,生成L-β-羟脂肪酰CoA。③再脱氢:在L-β-羟脂肪酰CoA脱氢酶的催化下,生成β-酮脂肪酰CoA和NADH+H+。④硫解:在硫解酶的催化下,分解生成1分子乙酰CoA和1分子减少了两个碳原子的脂肪酰CoA。后者可继续氧化分解,直至全部分解为乙酰CoA。 3.三羧酸循环:生成的乙酰CoA进入三羧酸循环彻底氧化分解。 三、脂肪酸氧化分解时的能量释放: 以16C的软脂酸为例来计算,则生成ATP的数目为:一分子软脂酸可经七次β-氧化全部分解为八分子乙酰CoA,故β-氧化可得5×7=35分子A TP,八分子乙酰CoA可得12×8=96分子ATP,故一共可得131分子A TP,减去活化时消耗的两分子ATP,故软脂酸可净生成129分子A TP。 对于偶数碳原子的长链脂肪酸,可按下式计算:A TP净生成数目=(碳原子数÷2 -1)×5 + (碳原子数÷2)×12 -2 。 四、酮体的生成及利用: 脂肪酸在肝脏中氧化分解所生成的乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮三种中间代谢产物,统称为酮体。 1.酮体的生成:酮体主要在肝脏的线粒体中生成,其合成原料为乙酰CoA,关键酶是HMG-CoA合成酶。 其过程为:乙酰CoA→乙酰乙酰CoA →HMG-CoA→乙酰乙酸。生成的乙酰乙酸再通过加氢反应转变为β-羟丁酸或经自发脱羧生成丙酮。 2.酮体的利用:利用酮体的酶有两种,即琥珀酰CoA转硫酶(主要存在于心、肾、脑和骨骼肌细胞的线粒体中,不消耗ATP)和乙酰乙酸硫激酶(主要存在于心、肾、脑细胞线粒体中,需消耗2分子ATP)。 其氧化利用酮体的过程为:β-羟丁酸→乙酰乙酸→乙酰乙酰CoA→乙酰CoA→三羧酸循环。 3.酮体生成及利用的生理意义: (1) 在正常情况下,酮体是肝脏输出能源的一种形式:由于酮体的分子较小,故被肝外组织氧化利用,成为肝脏向肝外组织输出能源的一种形式。 (2) 在饥饿或疾病情况下,为心、脑等重要器官提供必要的能源:在长期饥饿或某些疾病情况下,由于葡萄糖供应不足,心、脑等器官也可转变来利用酮体氧化分解供能。 五、甘油三酯的合成代谢: 肝脏、小肠和脂肪组织是主要的合成脂肪的组织器官,其合成的亚细胞部位主要在胞液。脂肪合成时,首先需要合成长链脂肪酸和3-磷酸甘油,然后再将二者缩合起来形成甘油三酯(脂肪)。 1.脂肪酸的合成:脂肪酸合成的原料是葡萄糖氧化分解后产生的乙酰CoA,其合成过程由胞液中的脂肪酸合成酶系催化,不是β-氧化过程的逆反应。脂肪酸合成的直接产物是软脂酸,然后再将其加工成其他种类的脂肪酸。 ⑴乙酰CoA转运出线粒体:线粒体内产生的乙酰CoA,与草酰乙酸缩合生成柠檬酸,穿过线粒体内膜进入胞液,裂解后重新生成乙酰CoA,产生的草酰乙酸转变为丙酮酸后重新进入线粒体,这一过程称为柠檬酸-丙酮酸穿梭作用。 ⑵丙二酸单酰CoA的合成:在乙酰CoA羧化酶(需生物素)的催化下,将乙酰CoA羧化为丙二酸单酰CoA。乙酰CoA羧化酶是脂肪酸合成的关键酶,属于变构酶,其活性受柠檬酸和异柠檬酸的变构激活,受长链脂酰CoA的变构抑制。 ⑶脂肪酸合成循环:脂肪酸合成时碳链的缩合延长过程是一类似于β-氧化逆反应的循环反应过程,即缩合→加氢→脱水→再加氢。所需氢原子来源于NADPH,故对磷酸戊糖旁路有依赖。每经过一次循环反应,延长两个碳原子。但该循环反应过程由胞液中的脂肪酸合成酶系所催化。 脂肪酸合成酶系在低等生物中是一种由一分子脂酰基载体蛋白(ACP)和七种酶单体所构成的多酶复合体;但在高等动物中,则是由一条多肽链构成的多功能酶,通常以二聚体形式存在,每个亚基都含有一ACP结构域。 ⑷软脂酸的碳链延长和不饱和脂肪酸的生成:此过程在线粒体/微粒体内进行。使用丙二酸单酰CoA与软脂酰CoA缩合,使碳链延长,最长可达二十四碳。不饱和键由脂类加氧酶系催化形成。 2.3-磷酸甘油的生成:合成甘油三酯所需的3-磷酸甘油主要由下列两条途径生成:①由糖代谢生成(脂肪细胞、肝脏):磷酸二羟丙酮加氢生成3-磷酸甘油。②由脂肪动员生成(肝):脂肪动员生成的甘油转运至肝脏经磷酸化后生成3-磷酸甘油。 3.甘油三酯的合成:2×脂酰CoA + 3-磷酸甘油→ 磷脂酸→ 甘油三酯。 六、甘油磷脂的代谢: 甘油磷脂由一分子的甘油,两分子的脂肪酸,一分子的磷酸和X基团构成。其X基团因不同的磷脂而不同,卵磷脂(磷脂酰胆碱)为胆碱,脑磷脂(磷脂酰乙醇胺)为胆胺,磷脂酰丝氨酸为丝氨酸,磷脂酰肌醇为肌醇。 1.甘油磷脂的合成代谢:甘油磷脂的合成途径有两条。 ⑴甘油二酯合成途径:磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺通过此代谢途径合成。合成过程中需消耗CTP,所需胆碱及乙醇胺以CDP-胆碱和CDP-乙醇胺的形式提供。 ⑵CDP-甘油二酯合成途径:磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和心磷脂通过此途径合成。合成过程中需消耗CTP,所需甘油二酯以CDP-甘油二酯的活性形式提供。 2.甘油磷脂的分解代谢:甘油磷脂的分解靠存在于体内的各种磷脂酶将其分解为脂肪酸、甘油、磷酸等,然后再进一步降解。 磷脂酶A1存在于蛇毒中,其降解产物为溶血磷脂2,后者有很强的溶血作用。溶血磷脂2可被磷脂酶B2降解 而失去其溶血作用。 七、鞘磷脂的代谢: 鞘脂类化合物中不含甘油,其脂质部分为鞘氨醇或N-脂酰鞘氨醇(神经酰胺)。鞘氨醇可在全身各组织细胞的内质网合成,合成所需的原料主要是软脂酰CoA和丝氨酸,并需磷酸吡哆醛、NADPH及FAD等辅助因子参与。体内含量最多的鞘磷脂是神经鞘磷脂,是构成生物膜的重要磷脂;合成时,在相应转移酶的催化下,将CDP-胆碱或CDP-乙醇胺携带的磷酸胆碱或磷酸乙醇胺转移至N-脂酰鞘氨醇上,生成神经鞘磷脂。 八、胆固醇的代谢: 胆固醇的基本结构为环戊烷多氢菲。胆固醇的酯化在C3位羟基上进行,由两种不同的酶催化。存在于血浆中的是卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT),而主要存在于组织细胞中的是脂肪酰CoA胆固醇酰基转移酶(ACAT)。 1.胆固醇的合成:胆固醇合成部位主要是在肝脏和小肠的胞液和微粒体。其合成所需原料为乙酰CoA。每合成一分子的胆固醇需18分子乙酰CoA,54分子A TP和10分子NADPH。 ⑴乙酰CoA缩合生成甲羟戊酸(MVA):此过程在胞液和微粒体进行。2×乙酰CoA→乙酰乙酰CoA→HMG-CoA→MV A。HMG-CoA还原酶是胆固醇合成的关键酶。 ⑵甲羟戊酸缩合生成鲨烯:此过程在胞液和微粒体进行。MV A→二甲丙烯焦磷酸→焦磷酸法呢酯→鲨烯。 ⑶鲨烯环化为胆固醇:此过程在微粒体进行。鲨烯结合在胞液的固醇载体蛋白(SCP)上,由微粒体酶进行催化,经一系列反应环化为27碳胆固醇。 2.胆固醇合成的调节:各种调节因素通过对胆固醇合成的关键酶——HMG-CoA还原酶活性的影响,来调节胆固醇合成的速度和合成量。 ⑴膳食因素:饥饿或禁食可抑制HMG-CoA还原酶的活性,从而使胆固醇的合成减少;反之,摄取高糖、高饱和脂肪膳食后,HMG-CoA活性增加而导致胆固醇合成增多。 ⑵胆固醇及其衍生物:胆固醇可反馈抑制HMG-CoA还原酶的活性。胆固醇的某些氧化物,如7β-羟胆固醇, 25-羟胆固醇等也可抑制该酶的活性。 ⑶激素:胰岛素和甲状腺激素可通过诱导该酶的合成而使酶活性增加;而胰高血糖素和糖皮质激素则可抑制该酶的活性。 3.胆固醇的转化:胆固醇主要通过转化作用,转变为其他化合物再进行代谢,或经粪便直接排出体外。 ⑴转化为胆汁酸:正常人每天合成的胆汁酸中有2/5通过转化为胆汁酸。初级胆汁酸是以胆固醇为原料在肝脏中合成的,合成的关键酶是7α-羟化酶。。主要的初级胆汁酸是胆酸和鹅脱氧胆酸。初级胆汁酸通常在其羧酸侧链上结合有一分子甘氨酸或牛磺酸,从而形成结合型初级胆汁酸,如甘氨胆酸,甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸。次级胆汁酸是在肠道细菌的作用下生成的。主要的次级胆汁酸是脱氧胆酸和石胆酸。 ⑵转化为类固醇激素:肾上腺皮质球状带可合成醛固酮,又称盐皮质激素,可调节水盐代谢;肾上腺皮质束状带可合成皮质醇和皮质酮,合称为糖皮质激素,可调节糖代谢。性激素主要有睾酮、孕酮和雌二醇。 ⑶转化为维生素D3:胆固醇经7位脱氢而转变为7-脱氢胆固醇,后者在紫外光的照射下,B环发生断裂,生成Vit-D3。Vit-D3在肝脏羟化为25-(OH)D3,再在肾脏被羟化为1,25-(OH)2 D3。1,25-(OH)2 D3为活性维生素D3。 九、血浆脂蛋白: 1.血浆脂蛋白的分类:①电泳分类法:根据电泳迁移率的不同进行分类,可分为四类:乳糜微粒→ β-脂蛋白→ 前β-脂蛋白→ α-脂蛋白。②超速离心法:按脂蛋白密度高低进行分类,也分为四类:CM → VLDL → LDL → HDL。 2.载脂蛋白的功能: ⑴转运脂类物质; ⑵作为脂类代谢酶的调节剂:LCA T可被ApoAⅠ等激活,也可被ApoAⅡ所抑制。LpL(脂蛋白脂肪酶)可被ApoCⅡ所激活,也可被ApoCⅢ所抑制。ApoAⅡ可激活HL的活性。 ⑶作为脂蛋白受体的识别标记:ApoB可被细胞膜上的ApoB,E受体(LDL受体)所识别;ApoE可被细胞膜上的ApoB,E受体和ApoE受体(LDL受体相关蛋白,LRP)所识别。ApoAⅠ参与HDL受体的识别。 ⑷参与脂质转运:CETP可促进胆固醇酯由HDL转移至VLDL和LDL;PTP可促进磷脂由CM和VLDL转移至HDL。 3.血浆脂蛋白的代谢和功能:乳糜微粒在小肠粘膜细胞组装,与外源性甘油三酯的转运有关;极低密度脂蛋白在肝脏组装,与内源性甘油三酯的转运有关;低密度脂蛋白由VLDL代谢产生,可将肝脏合成的胆固醇转运至肝外组织细胞;高密度脂蛋白来源广泛,与胆固醇的逆向转运有关。 第七章生物氧化 一、生物氧化的概念和特点: 物质在生物体内氧化分解并释放出能量的过程称为生物氧化。与体外燃烧一样,生物氧化也是一个消耗O2,生成CO2和H2O,并释放出大量能量的过程。但与体外燃烧不同的是,生物氧化过程是在37℃,近于中性的含水环境中,由酶催化进行的;反应逐步释放出能量,相当一部分能量以高能磷酸酯键的形式储存起来。 二、线粒体氧化呼吸链: 在线粒体中,由若干递氢体或递电子体按一定顺序排列组成的,与细胞呼吸过程有关的链式反应体系称为呼吸链。这些递氢体或递电子体往往以复合体的形式存在于线粒体内膜上。主要的复合体有: 1.复合体Ⅰ(NADH-泛醌还原酶):由一分子NADH还原酶(FMN),两分子铁硫蛋白(Fe-S)和一分子CoQ 组成,其作用是将(NADH+H+)传递给CoQ。 铁硫蛋白分子中含有非血红素铁和对酸不稳定的硫。其分子中的铁离子与硫原子构成一种特殊的正四面体 结构,称为铁硫中心或铁硫簇,铁硫蛋白是单电子传递体。泛醌(CoQ)是存在于线粒体内膜上的一种脂溶性醌类化合物。分子中含对苯醌结构,可接受二个氢原子而转变成对苯二酚结构,是一种双递氢体。 2.复合体Ⅱ(琥珀酸-泛醌还原酶):由一分子琥珀酸脱氢酶(FAD),两分子铁硫蛋白和两分子Cytb560组成,其作用是将FADH2传递给CoQ。 细胞色素类:这是一类以铁卟啉为辅基的蛋白质,为单电子传递体。细胞色素可存在于线粒体内膜,也可存在于微粒体。存在于线粒体内膜的细胞色素有Cytaa3,Cytb(b560,b562,b566),Cytc,Cytc1;而存在于微粒体的细胞色素有CytP450和Cytb5。 3.复合体Ⅲ(泛醌-细胞色素c还原酶):由两分子Cytb(分别为Cytb562和Cytb566),一分子Cytc1和一分子铁硫蛋白组成,其作用是将电子由泛醌传递给Cytc。 4.复合体Ⅳ(细胞色素c氧化酶):由一分子Cyta和一分子Cyta3组成,含两个铜离子,可直接将电子传递给氧,故Cytaa3又称为细胞色素c氧化酶,其作用是将电子由Cytc传递给氧。 三、呼吸链成分的排列顺序: 由上述递氢体或递电子体组成了NADH氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链两条呼吸链。 1.NADH氧化呼吸链:其递氢体或递电子体的排列顺序为:NAD+ →[ F MN (Fe-S)]→CoQ→b(Fe-S)→ c1 → c →aa3 →1/2O2 。丙酮酸、α-酮戊二酸、异柠檬酸、苹果酸、β-羟丁酸、β-羟脂酰CoA和谷氨酸脱氢后经此呼吸链递氢。 2.琥珀酸氧化呼吸链:其递氢体或递电子体的排列顺序为:[ FAD (Fe-S)]→CoQ→b(Fe-S)→ c1 → c →aa3 →1/2O2 。琥珀酸、3-磷酸甘油(线粒体)和脂酰CoA脱氢后经此呼吸链递氢。 四、生物体内能量生成的方式: 1.氧化磷酸化:在线粒体中,底物分子脱下的氢原子经递氢体系传递给氧,在此过程中释放能量使ADP磷酸化生成ATP,这种能量的生成方式就称为氧化磷酸化。 2.底物水平磷酸化:直接将底物分子中的高能键转变为ATP分子中的末端高能磷酸键的过程称为底物水平磷酸化。 五、氧化磷酸化的偶联部位: 每消耗一摩尔氧原子所消耗的无机磷的摩尔数称为P/O比值。当底物脱氢以NAD+为受氢体时,P/O比值约为3;而当底物脱氢以FAD为受氢体时,P/O比值约为2。故NADH氧化呼吸链有三个生成ATP的偶联部位,而琥珀酸氧化呼吸链只有两个生成A TP的偶联部位。 六、氧化磷酸化的偶联机制: 目前公认的机制是1961年由Mitchell提出的化学渗透学说。这一学说认为氧化呼吸链存在于线粒体内膜上,当氧化反应进行时,H+通过氢泵作用(氧化还原袢)被排斥到线粒体内膜外侧(膜间腔),从而形成跨膜pH梯度和跨膜电位差。这种形式的能量,可以被存在于线粒体内膜上的ATP合酶利用,生成高能磷酸基团,并与ADP结合而合成A TP。 在电镜下,ATP合酶分为三个部分,即头部,柄部和基底部。但如用生化技术进行分离,则只能得到F0(基底部+部分柄部)和F1(头部+部分柄部)两部分。ATP合酶的中心存在质子通道,当质子通过这一通道进入线粒体基质时,其能量被头部的A TP合酶催化活性中心利用以合成A TP。 七、氧化磷酸化的影响因素: 1.ATP/ADP比值:ATP/ADP比值是调节氧化磷酸化速度的重要因素。ATP/ADP比值下降,可致氧化磷酸化速度加快;反之,当ATP/ADP比值升高时,则氧化磷酸化速度减慢。 2.甲状腺激素:甲状腺激素可以激活细胞膜上的Na+,K+-ATP酶,使ATP水解增加,因而使ATP/ADP比值下降,氧化磷酸化速度加快。 3.药物和毒物: ⑴呼吸链的抑制剂:能够抑制呼吸链递氢或递电子过程的药物或毒物称为呼吸链的抑制剂。能够抑制第一位点的有异戊巴比妥、粉蝶霉素A、鱼藤酮等;能够抑制第二位点的有抗霉素A和二巯基丙醇;能够抑制第三位点的有CO、H2S和CN-、N3-。其中,CN-和N3-主要抑制氧化型Cytaa3-Fe3+,而CO和H2S主要抑制还原型Cytaa3-Fe2+。 ⑵解偶联剂:不抑制呼吸链的递氢或递电子过程,但能使氧化产生的能量不能用于ADP的磷酸化的试剂称为解偶联剂。其机理是增大了线粒体内膜对H+的通透性,使H+的跨膜梯度消除,从而使氧化过程释放的能量不能用于ATP的合成反应。主要的解偶联剂有2,4-二硝基酚。 ⑶氧化磷酸化的抑制剂:对电子传递和ADP磷酸化均有抑制作用的药物和毒物称为氧化磷酸化的抑制剂,如寡霉素。 八、高能磷酸键的类型: 生物化学中常将水解时释放的能量>20kJ/mol的磷酸键称为高能磷酸键,主要有以下几种类型: 1.磷酸酐键:包括各种多磷酸核苷类化合物,如ADP,ATP等。 2.混合酐键:由磷酸与羧酸脱水后形成的酐键,主要有1,3-二磷酸甘油酸等化合物。 3.烯醇磷酸键:见于磷酸烯醇式丙酮酸中。 4.磷酸胍键:见于磷酸肌酸中,是肌肉和脑组织中能量的贮存形式。磷酸肌酸中的高能磷酸键不能被直接利用,而必须先将其高能磷酸键转移给ATP,才能供生理活动之需。这一反应过程由肌酸磷酸激酶(CPK)催化完成。 九、线粒体外NADH的穿梭: 胞液中的3-磷酸甘油醛或乳酸脱氢,均可产生NADH。这些NADH可经穿梭系统而进入线粒体氧化磷酸化,产生H2O和ATP。 1.磷酸甘油穿梭系统:这一系统以3-磷酸甘油和磷酸二羟丙酮为载体,在两种不同的α-磷酸甘油脱氢酶的催化下,将胞液中NADH的氢原子带入线粒体中,交给FAD,再沿琥珀酸氧化呼吸链进行氧化磷酸化。因此,如NADH通过此穿梭系统带一对氢原子进入线粒体,则只得到2分子ATP。 2.苹果酸穿梭系统:此系统以苹果酸和天冬氨酸为载体,在苹果酸脱氢酶和谷草转氨酶的催化下。将胞液中NADH的氢原子带入线粒体交给NAD+,再沿NADH氧化呼吸链进行氧化磷酸化。因此,经此穿梭系统带入一对氢原子可生成3分子ATP。 第八章氨基酸代谢 一、蛋白质的营养作用: 1.蛋白质的生理功能:主要有:①是构成组织细胞的重要成分;②参与组织细胞的更新和修补;③参与物质代谢及生理功能的调控;④氧化供能;⑤其他功能:如转运、凝血、免疫、记忆、识别等。 2.氮平衡:体内蛋白质的合成与分解处于动态平衡中,故每日氮的摄入量与排出量也维持着动态平衡,这种 动态平衡就称为氮平衡。氮平衡有以下几种情况: ⑴氮总平衡:每日摄入氮量与排出氮量大致相等,表示体内蛋白质的合成量与分解量大致相等,称为氮总平衡。此种情况见于正常成人。 ⑵氮正平衡:每日摄入氮量大于排出氮量,表明体内蛋白质的合成量大于分解量,称为氮正平衡。此种情况见于儿童、孕妇、病后恢复期。 ⑶氮负平衡:每日摄入氮量小于排出氮量,表明体内蛋白质的合成量小于分解量,称为氮负平衡。此种情况见于消耗性疾病患者(结核、肿瘤),饥饿者。 3.必需氨基酸与非必需氨基酸:体内不能合成,必须由食物蛋白质供给的氨基酸称为必需氨基酸。反之,体内能够自行合成,不必由食物供给的氨基酸就称为非必需氨基酸。 必需氨基酸一共有八种:赖氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)、苏氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)。酪氨酸和半胱氨酸必需以必需氨基酸为原料来合成,故被称为半必需氨基酸。 4.蛋白质的营养价值及互补作用:蛋白质营养价值高低的决定因素有:①必需氨基酸的含量;②必需氨基酸的种类;③必需氨基酸的比例,即具有与人体需求相符的氨基酸组成。将几种营养价值较低的食物蛋白质混合后食用,以提高其营养价值的作用称为食物蛋白质的互补作用。 二、蛋白质的消化、吸收与腐败 1.蛋白质的消化:胃蛋白酶水解食物蛋白质为多肽,再在小肠中完全水解为氨基酸。 2.氨基酸的吸收:主要在小肠进行,是一种主动转运过程,需由特殊载体携带。除此之外,也可经γ-谷氨酰循环进行。 3.蛋白质在肠中的腐败:主要在大肠中进行,是细菌对蛋白质及其消化产物的分解作用,可产生有毒物质。 三、氨基酸的脱氨基作用: 氨基酸主要通过三种方式脱氨基,即氧化脱氨基,联合脱氨基和非氧化脱氨基。 1.氧化脱氨基:反应过程包括脱氢和水解两步,反应主要由L-氨基酸氧化酶和谷氨酸脱氢酶所催化。L-氨基酸氧化酶是一种需氧脱氢酶,该酶在人体内作用不大。谷氨酸脱氢酶是一种不需氧脱氢酶,以NAD+或NADP+为辅酶。该酶作用较大,属于变构酶,其活性受ATP,GTP的抑制,受ADP,GDP的激活。 2.转氨基作用:由转氨酶催化,将α-氨基酸的氨基转移到α-酮酸酮基的位置上,生成相应的α-氨基酸,而原来的α-氨基酸则转变为相应的α-酮酸。转氨酶以磷酸吡哆醛(胺)为辅酶。转氨基作用可以在各种氨基酸与α-酮酸之间普遍进行。除Gly,Lys,Thr,Pro外,均可参加转氨基作用。较为重要的转氨酶有: ⑴丙氨酸氨基转移酶(ALT),又称为谷丙转氨酶(GPT)。催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基移换反应,为可逆反应。该酶在肝脏中活性较高,在肝脏疾病时,可引起血清中ALT活性明显升高。 ⑵天冬氨酸氨基转移酶(AST),又称为谷草转氨酶(GOT)。催化天冬氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基移换反应,为可逆反应。该酶在心肌中活性较高,故在心肌疾患时,血清中AST活性明显升高。 3.联合脱氨基作用:转氨基作用与氧化脱氨基作用联合进行,从而使氨基酸脱去氨基并氧化为α-酮酸的过程,称为联合脱氨基作用。可在大多数组织细胞中进行,是体内主要的脱氨基的方式。 4.嘌呤核苷酸循环(PNC):这是存在于骨骼肌和心肌中的一种特殊的联合脱氨基作用方式。在骨骼肌和心肌中,腺苷酸脱氨酶的活性较高,该酶可催化AMP脱氨基,此反应与转氨基反应相联系,即构成嘌呤核苷酸循环的脱氨基作用。 四、α-酮酸的代谢: 1.再氨基化为氨基酸。 2.转变为糖或脂:某些氨基酸脱氨基后生成糖异生途径的中间代谢物,故可经糖异生途径生成葡萄糖,这些氨基酸称为生糖氨基酸。个别氨基酸如Leu,Lys,经代谢后只能生成乙酰CoA或乙酰乙酰CoA,再转变为脂或酮体,故称为生酮氨基酸。而Phe,Tyr,Ile,Thr,Trp经分解后的产物一部分可生成葡萄糖,另一部分则生成乙酰CoA,故称为生糖兼生酮氨基酸。 3.氧化供能:进入三羧酸循环彻底氧化分解供能。 五、氨的代谢: 1.血氨的来源与去路: ⑴血氨的来源:①由肠道吸收;②氨基酸脱氨基;③氨基酸的酰胺基水解;④其他含氮物的分解。 ⑵血氨的去路:①在肝脏转变为尿素;②合成氨基酸;③合成其他含氮物;④合成天冬酰胺和谷氨酰胺;⑤直接排出。 2.氨在血中的转运:氨在血液循环中的转运,需以无毒的形式进行,如生成丙氨酸或谷氨酰胺等,将氨转运至肝脏或肾脏进行代谢。 ⑴丙氨酸-葡萄糖循环:肌肉中的氨基酸将氨基转给丙酮酸生成丙氨酸,后者经血液循环转运至肝脏再脱氨基,生成的丙酮酸经糖异生转变为葡萄糖后再经血液循环转运至肌肉重新分解产生丙酮酸,这一循环过程就称为丙氨酸-葡萄糖循环。 ⑵谷氨酰胺的运氨作用:肝外组织,如脑、骨骼肌、心肌在谷氨酰胺合成酶的催化下,合成谷氨酰胺,以谷氨酰胺的形式将氨基经血液循环带到肝脏,再由谷氨酰胺酶将其分解,产生的氨即可用于合成尿素。因此,谷氨酰胺对氨具有运输、贮存和解毒作用。 3.鸟氨酸循环与尿素的合成:体内氨的主要代谢去路是用于合成尿素。合成尿素的主要器官是肝脏,但在肾及脑中也可少量合成。尿素合成是经鸟氨酸循环的反应过程来完成,催化这些反应的酶存在于胞液和线粒体中。其主要反应过程如下:NH3+CO2+2ATP →氨基甲酰磷酸→胍氨酸→精氨酸代琥珀酸→精氨酸→尿素+鸟氨酸。尿素合成的特点:①合成主要在肝脏的线粒体和胞液中进行;②合成一分子尿素需消耗四分子ATP;③精氨酸代琥珀酸合成酶是尿素合成的关键酶;④尿素分子中的两个氮原子,一个来源于NH3,一个来源于天冬氨酸。 六、氨基酸的脱羧基作用: 由氨基酸脱羧酶催化,辅酶为磷酸吡哆醛,产物为CO2和胺。 1.γ-氨基丁酸的生成:γ-氨基丁酸(GABA)是一种重要的神经递质,由L-谷氨酸脱羧而产生。反应由L-谷氨酸脱羧酶催化,在脑及肾中活性很高。 2.5-羟色胺的生成:5-羟色胺(5-HT)也是一种重要的神经递质,且具有强烈的缩血管作用,其合成原料是色氨酸。合成过程为:色氨酸→5羟色氨酸→5-羟色胺。 3.组胺的生成:组胺由组氨酸脱羧产生,具有促进平滑肌收缩,促进胃酸分泌和强烈的舒血管作用。 4.多胺的生成:精脒和精胺均属于多胺,它们与细胞生长繁殖的调节有关。合成的原料为鸟氨酸,关键酶是鸟氨酸脱羧酶。 七、一碳单位的代谢: 一碳单位是指只含一个碳原子的有机基团,这些基团通常由其载体携带参加代谢反应。常见的一碳单位有甲基(-CH3)、亚甲基或甲烯基(-CH2-)、次甲基或甲炔基(=CH-)、甲酰基(-CHO)、亚氨甲基(-CH=NH)、羟甲基(-CH2OH)等。 一碳单位通常由其载体携带,常见的载体有四氢叶酸(FH4)和S-腺苷同型半胱氨酸,有时也可为VitB12。 常见的一碳单位的四氢叶酸衍生物有:①N10-甲酰四氢叶酸(N10-CHO FH4);②N5-亚氨甲基四氢叶酸(N5-CH=NH FH4);③N5,N10-亚甲基四氢叶酸(N5,N10-CH2-FH4);④N5,N10-次甲基四氢叶酸(N5,N10=CH-FH4);⑤N5-甲基四氢叶酸(N5-CH3 FH4)。 苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸和色氨酸代谢降解后可生成N10-甲酰四氢叶酸,后者可用于嘌呤C2原子的合成;苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸和组氨酸代谢降解后可生成N5,N10-次甲基四氢叶酸,后者可用于嘌呤C8原子的合成;丝氨酸代谢降解后可生成N5,N10-亚甲基四氢叶酸,后者可用于胸腺嘧啶甲基的合成。 八、S-腺苷蛋氨酸循环: 蛋氨酸是体内合成许多重要化合物,如肾上腺素、胆碱、肌酸和核酸等的甲基供体。其活性形式为S-腺苷蛋氨酸(SAM)。SAM也是一种一碳单位衍生物,其载体可认为是S-腺苷同型半胱氨酸,携带的一碳单位是甲基。从蛋氨酸形成的S-腺苷蛋氨酸,在提供甲基以后转变为同型半胱氨酸,然后再反方向重新合成蛋氨酸,这一循环反应过程称为S-腺苷蛋氨酸循环或活性甲基循环。 九、芳香族氨基酸的代谢: 在神经组织细胞中的主要代谢过程为:苯丙氨酸→酪氨酸→多巴→多巴胺→去甲肾上腺素→肾上腺素。多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素统称儿茶酚胺。在黑色素细胞中,多巴可转变为黑色素。苯丙氨酸羟化酶遗传性缺陷可致苯丙酮酸尿症,酪氨酸酶遗传性缺陷可致白化病。 第九章核苷酸代谢 一、核苷酸类物质的生理功用: 核苷酸类物质在人体内的生理功用主要有: ①作为合成核酸的原料:如用ATP,GTP,CTP,UTP合成RNA,用dATP,dGTP,dCTP,dTTP合成DNA。 ②作为能量的贮存和供应形式:除ATP之外,还有GTP,UTP,CTP等。 ③参与代谢或生理活动的调节:如环核苷酸cAMP和cGMP作为激素的第二信使。 ④参与构成酶的辅酶或辅基:如在NAD+,NADP+,FAD,FMN,CoA中均含有核苷酸的成分。 ⑤作为代谢中间物的载体:如用UDP携带糖基,用CDP携带胆碱,胆胺或甘油二酯,用腺苷携带蛋氨酸(SAM)等。 二、嘌呤核苷酸的合成代谢: 1.从头合成途径:利用一些简单的前体物,如5-磷酸核糖,氨基酸,一碳单位及CO2等,逐步合成嘌呤核苷酸的过程称为从头合成途径。这一途径主要见于肝脏,其次为小肠和胸腺。 嘌呤环中各原子分别来自下列前体物质:Asp → N1;N10-CHO FH4 → C2 ;Gln → N3和N9 ;CO2 → C6 ; N5,N10=CH-FH4 → C8 ;Gly → C4 、C5 和N7。 合成过程可分为三个阶段: ⑴次黄嘌呤核苷酸的合成:在磷酸核糖焦磷酸合成酶的催化下,消耗ATP,由5'-磷酸核糖合成PRPP(1'-焦磷酸-5'-磷酸核糖)。然后再经过大约10步反应,合成第一个嘌呤核苷酸——次黄苷酸(IMP)。 ⑵腺苷酸及鸟苷酸的合成:IMP在腺苷酸代琥珀酸合成酶的催化下,由天冬氨酸提供氨基合成腺苷酸代琥珀酸(AMP-S),然后裂解产生AMP;IMP也可在IMP脱氢酶的催化下,以NAD+为受氢体,脱氢氧化为黄苷酸(XMP),后者再在鸟苷酸合成酶催化下,由谷氨酰胺提供氨基合成鸟苷酸(GMP)。 ⑶三磷酸嘌呤核苷的合成:AMP/GMP被进一步磷酸化,最后生成ATP/GTP,作为合成RNA的原料。ADP/GDP 则可在核糖核苷酸还原酶的催化下,脱氧生成dADP/dGDP,然后再磷酸化为dATP/dGTP,作为合成DNA的原料。 2.补救合成途径:又称再利用合成途径。指利用分解代谢产生的自由嘌呤碱合成嘌呤核苷酸的过程。这一途径可在大多数组织细胞中进行。其反应为:A + PRPP → AMP;G/I + PRPP → GMP/IMP。 3.抗代谢药物对嘌呤核苷酸合成的抑制:能够抑制嘌呤核苷酸合成的一些抗代谢药物,通常是属于嘌呤、氨基酸或叶酸的类似物,主要通过对代谢酶的竞争性抑制作用,来干扰或抑制嘌呤核苷酸的合成,因而具有抗肿瘤治疗作用。在临床上应用较多的嘌呤核苷酸类似物主要是6-巯基嘌呤(6-MP)。6-MP的化学结构与次黄嘌呤类似,因而可以抑制IMP转变为AMP或GMP,从而干扰嘌呤核苷酸的合成。 三、嘌呤核苷酸的分解代谢: 嘌呤核苷酸的分解首先是在核苷酸酶的催化下,脱去磷酸生成嘌呤核苷,然后再在核苷酶的催化下分解生成嘌呤碱,最后产生的I和X经黄嘌呤氧化酶催化氧化生成终产物尿酸。痛风症患者由于体内嘌呤核苷酸分解代谢异常,可致血中尿酸水平升高,以尿酸钠晶体沉积于软骨、关节、软组织及肾脏,临床上表现为皮下结节,关节疼痛等。可用别嘌呤醇予以治疗。 四、嘧啶核苷酸的合成代谢: 1.从头合成途径:指利用一些简单的前体物逐步合成嘧啶核苷酸的过程。该过程主要在肝脏的胞液中进行。嘧啶环中各原子分别来自下列前体物:CO2→C2 ;Gln→N3 ;Asp →C4 、C5 、C6 、N1 。嘧啶核苷酸的主要合成步骤为: ⑴尿苷酸的合成:在氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ的催化下,以Gln,CO2,ATP等为原料合成氨基甲酰磷酸。后者在天冬氨酸转氨甲酰酶的催化下,转移一分子天冬氨酸,从而合成氨甲酰天冬氨酸,然后再经脱氢、脱羧、环化等反应,合成第一个嘧啶核苷酸,即UMP。 ⑵胞苷酸的合成:UMP经磷酸化后生成UTP,再在胞苷酸合成酶的催化下,由Gln提供氨基转变为CTP。 ⑶脱氧嘧啶核苷酸的合成:①CTP→CDP→dCDP→dCTP。②dCDP→dCMP→dUMP→dTMP→dTDP→dTTP。胸苷酸合成酶催化dUMP甲基化,甲基供体为N5,N10-亚甲基四氢叶酸。 2.补救合成途径:由分解代谢产生的嘧啶/嘧啶核苷转变为嘧啶核苷酸的过程称为补救合成途径。以嘧啶核苷的补救合成途径较重要。主要反应为:UR/CR + ATP → UMP/CMP;TdR + ATP → dTMP。 3.抗代谢药物对嘧啶核苷酸合成的抑制:能够抑制嘧啶核苷酸合成的抗代谢药物也是一些嘧啶核苷酸的类似物,通过对酶的竞争性抑制而干扰或抑制嘧啶核苷酸的合成。主要的抗代谢药物是5-氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU 在体内可转变为F-dUMP,其结构与dUMP相似,可竞争性抑制胸苷酸合成酶的活性,从而抑制胸苷酸的合成。 五、嘧啶核苷酸的分解代谢: 嘧啶核苷酸可首先在核苷酸酶和核苷磷酸化酶的催化下,除去磷酸和核糖,产生的嘧啶碱可在体内进一步分解代谢。不同的嘧啶碱其分解代谢的产物不同,其降解过程主要在肝脏进行。 胞嘧啶和尿嘧啶降解的终产物为(β-丙氨酸+ NH3 + CO2 );胸腺嘧啶降解的终产物为(β-氨基异丁酸+ NH3 + CO2 )。 第十章DNA的生物合成 一、遗传学的中心法则和反中心法则: DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代;通过转录和翻译,将遗传信息传递给蛋白质分子,从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。但在少数RNA病毒中,其遗传信息贮存在RNA中。因此,在这些生物体中,遗传信息的流向是RNA通过复制,将遗传信息由亲代传递给子代;通过反转录将遗传信息传递给DNA,再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质,这种遗传信息的流向就称为反中心法则。 二、DNA复制的特点: 1.半保留复制:DNA在复制时,以亲代DNA的每一股作模板,合成完全相同的两个双链子代DNA,每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链,这种现象称为DNA的半保留复制(semiconservative replication)。DNA以半保留方式进行复制,是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。 2.有一定的复制起始点:DNA在复制时,需在特定的位点起始,这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段,即复制起始点(复制子)。在原核生物中,复制起始点通常为一个,而在真核生物中则为多个。 3.需要引物(primer):DNA聚合酶必须以一段具有3'端自由羟基(3'-OH)的RNA作为引物,才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小,在原核生物中通常为50~100个核苷酸,而在真核生物中约为10个核苷酸。 4.双向复制:DNA复制时,以复制起始点为中心,向两个方向进行复制。但在低等生物中,也可进行单向复制。 5.半不连续复制:由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链,因此两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在聚合时基本上是连续进行的,这一条链被称为领头链(leading strand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在聚合时则是不连续的,这条链被称为随从链(lagging strand)。DNA在复制时,由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。冈崎片段的大小,在原核生物中约为1000~2000个核苷酸,而在真核生物中约为100个核苷酸。 三、DNA复制的条件: 1.底物:以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)为底物,即dATP,dGTP,dCTP,dTTP。 2.模板(template):以亲代DNA的两股链解开后,分别作为模板进行复制。 3.引发体(primosome)和RNA引物(primer):引发体由引发前体与引物酶(primase)组装而成。引发前体是由若干蛋白因子聚合而成的复合体;引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP)。 4.DNA聚合酶(DNA dependent DNA polymerase, DDDP): ⑴种类和生理功能:在原核生物中,目前发现的DNA聚合酶有三种,分别命名为DNA聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ), DNA聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ),DNA聚合酶Ⅲ(pol Ⅲ),这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。pol Ⅰ为单 一肽链的大分子蛋白质,具有5'→3'聚合酶活性、3'→5'外切酶活性和5'→3'外切酶的活性;其功能主要是去除引物、填补缺口以及修复损伤。pol Ⅱ具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,其功能不明。pol Ⅲ是由十种亚基组成的不对称二聚体,具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,与DNA复制功能有关。 在真核生物中,目前发现的DNA聚合酶有五种。其中,参与染色体DNA复制的是pol α(延长随从链)和pol δ(延长领头链),参与线粒体DNA复制的是pol γ,polε与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关,pol β只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。 ⑵DNA复制的保真性:为了保证遗传的稳定,DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关:①遵守严格的碱基配对规律;②在复制时对碱基的正确选择;③对复制过程中出现的错误及时进行校正。 5.DNA连接酶(DNA ligase):DNA连接酶可催化两段DN**段之间磷酸二酯键的形成,而使两段DNA连接起来。该酶催化的条件是:①需一段DN**段具有3'-OH,而另一段DN**段具有5'-Pi基;②未封闭的缺口位于双链DNA中,即其中有一条链是完整的;③需要消耗能量,在原核生物中由NAD+供能,在真核生物中由ATP供能。 6.单链DNA结合蛋白(single strand binding protein, SSB):又称螺旋反稳蛋白(HDP)。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为:①稳定单链DNA,便于以其为模板复制子代DNA;②保护单链DNA,避免核酸酶的降解。 7.解螺旋酶(unwinding enzyme):又称解链酶或rep蛋白,是用于解开DNA双链的酶蛋白,每解开一对碱基,需消耗两分子ATP。 8.拓扑异构酶(topoisomerase):拓扑异构酶可将DNA双链中的一条链或两条链切断,松开超螺旋后再将DNA 链连接起来,从而避免出现链的缠绕。 四、DNA生物合成过程: 1.复制的起始: ⑴预引发:①解旋解链,形成复制叉:由拓扑异构酶和解链酶作用,使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开,形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白(SSB)结合在单链DNA上,形成复制叉。DNA复制时,局部双螺旋解开形成两条单链,这种叉状结构称为复制叉。②引发体组装:由引发前体蛋白因子识别复制起始点,并与引发酶一起组装形成引发体。 ⑵引发:在引发酶的催化下,以DNA链为模板,合成一段短的RNA引物。 2.复制的延长: ⑴聚合子代DNA:由DNA聚合酶催化,以亲代DNA链为模板,从5'→3'方向聚合子代DNA链。 ⑵引发体移动:引发体向前移动,解开新的局部双螺旋,形成新的复制叉,随从链重新合成RNA引物,继续进行链的延长。 3.复制的终止: ⑴去除引物,填补缺口:RNA引物被水解,缺口由DNA链填补,直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。 ⑵连接冈崎片段:在DNA连接酶的催化下,将冈崎片段连接起来,形成完整的DNA长链。 ⑶真核生物端粒(telomere)的形成:端粒是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分,通常膨大成粒状。线性DNA在复制完成后,其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶(telomerase)的催化下,进行延长反应。端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体,它可以其RNA为模板,通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。 五、DNA的损伤: 由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联,链的断裂,重组等。引起DNA损伤的因素有: 1.自发因素: (1)自发脱碱基:由于N-糖苷键的自发断裂,引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。 (2)自发脱氨基:C自发脱氨基可生成U,A自发脱氨基可生成I。 (3)复制错配:由于复制时碱基配对错误引起的损伤。 2.物理因素:由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中,X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂,而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成,如TT,TC,CC等二聚体。 3.化学因素: (1)脱氨剂:如亚硝酸与亚硝酸盐,可加速C脱氨基生成U,A脱氨基生成I。 (2)烷基化剂:这是一类带有活性烷基的化合物,可提供甲基或其他烷基,引起碱基或磷酸基的烷基化,甚至可引起邻近碱基的交联。 (3)DNA加合剂:如苯并芘,在体内代谢后生成四羟苯并芘,与嘌呤共价结合引起损伤。 (4)碱基类似物:如5-FU,6-MP等,可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。 (5)断链剂:如过氧化物,含巯基化合物等,可引起DNA链的断裂。 六、DNA突变的类型: 1.点突变:转换——相同类型碱基的取代。颠换——不同类型碱基的取代。插入——增加一个碱基。缺失——减少一个碱基。 2.复突变:插入——增加一段顺序。缺失——减少一段顺序。倒位——一段碱基顺序发生颠倒。易位——一段碱基顺序的位置发生改变。重组——一段碱基顺序与另一段碱基顺序发生交换。 七、DNA突变的效应: 1.同义突变:基因突变导致mRNA密码子第三位碱基的改变但不引起密码子意义的改变,其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变。 2.误义突变:基因突变导致mRNA密码子碱基被置换,其意义发生改变,翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。 3.无义突变:基因突变导致mRNA密码子碱基被置换而改变成终止暗码子,引起多肽链合成的终止。 4.移码突变:基因突变导致mRNA密码子碱基被置换,引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。 八、DNA损伤的修复: DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。直接修复包括光复活、转甲基作用和直接连接作用,均属于无差错修复。取代修复包括切除修复、重组修复和SOS修复,后二者属于有差错倾向修复。 1.光复活:由光复活酶识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物,在可见光照射下,酶获得能量,将嘧啶二聚体的丁酰环打开,使之完全修复。 2.转甲基作用:在转甲基酶的催化下,将DNA上的被修饰的甲基去除。此时,转甲基酶自身被甲基化而失活。 3.直接连接:DNA断裂形成的缺口,可以在DNA连接酶的催化下,直接进行连接而封闭缺口。 4.切除修复:这种修复机制可适用于多种DNA损伤的修复。该修复机制可以分别由两种不同的酶来发动,一种是核酸内切酶,另一种是DNA糖苷酶。①特异性的核酸内切酶(如原核中的UvrA、UvrB和UvrC)或DNA 糖苷酶识别DNA受损伤的部位,并在该部位的5'端作一切口;②由核酸外切酶(或DNA聚合酶Ⅰ)从5'→3'端逐一切除损伤的单链;③在DNA聚合酶的催化下,以互补链为模板,合成新的单链片段以填补缺口;④由DNA连接酶催化连接片段,封闭缺口。 5.重组修复:①DNA复制时,损伤部位导致子链DNA合成障碍,形成空缺;②此空缺诱导产生重组酶(重组蛋白RecA),该酶与空缺区结合,并催化子链空缺与对侧亲链进行重组交换;③对侧亲链产生的空缺以互补的子链为模板,在DNA聚合酶和连接酶的催化下,重新修复缺口;④亲链上的损伤部位继续保留或以切除修复方式加以修复。 6.SOS修复:这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制,以SOS借喻细胞处于危急状态。 第十一章RNA的生物合成 一、RNA转录合成的特点: 在RNA聚合酶的催化下,以一段DNA链为模板合成RNA,从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录。经转录生成的RNA有多种,主要的是rRNA,tRNA,mRNA,snRNA和HnRNA。 1.转录的不对称性:指以双链DNA中的一条链作为模板进行转录,从而将遗传信息由DNA传递给RNA。对于不同的基因来说,其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。能够转录RNA的那条DNA链称为有意义链(模板链),而与之互补的另一条DNA链称为反意义链(编码链)。 2.转录的连续性:RNA转录合成时,在RNA聚合酶的催化下,连续合成一段RNA链,各条RNA链之间无需再进行连接。 3.转录的单向性:RNA转录合成时,只能向一个方向进行聚合,RNA链的合成方向为5'→3'。 4.有特定的起始和终止位点:RNA转录合成时,只能以DNA分子中的某一段作为模板,故存在特定的起始位点和特定的终止位点。 二、RNA转录合成的条件: 1.底物:四种核糖核苷酸,即ATP,GTP,CTP,UTP。 2.模板:以一段单链DNA作为模板。 3.RNA聚合酶(DDRP):RNA聚合酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下,不需要引物,即可从5'→3'聚合RNA。 原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成,即α2ββ'ζ。ζ亚基与转录起始点的识别有关,而在转录合成开始后被释放,余下的部分(α2ββ')被称为核心酶,与RNA链的聚合有关。 真核生物中的RNA聚合酶分为三种:RNA polⅠ存在于核仁,对α-鹅膏蕈碱不敏感,用于合成rRNA前体;RNA polⅡ存在于核基质,对α-鹅膏蕈碱极敏感,用于合成HnRNA;RNA polⅢ存在于核基质,对α-鹅膏蕈碱敏感,用于合成tRNA前体、snRNA及5S rRNA。 4.终止因子ρ蛋白:这是一种六聚体的蛋白质,能识别终止信号,并能与RNA紧密结合,导致RNA的释放。 5.激活因子:降解产物基因激活蛋白(CAP),又称为cAMP受体蛋白(CRP),是一种二聚体蛋白质。该蛋白与cAMP结合后,刺激RNA聚合酶与起始部位结合,从而起始转录过程。 三、RNA转录合成的基本过程: 1.识别:RNA聚合酶中的ζ因子识别转录起始点,并促使核心酶结合形成全酶复合物。 位于基因上游,与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA顺序称为启动子。在原核生物中的启动子通常长约60bp,存在两段带共性的顺序,即5'-TTGACA-3'和5'-TATAATG-3',其中富含TA的顺序被称为Pribnow盒。真核生物的启动子中也存在一段富含TA的顺序,被称为Hogness盒或TA TA盒。 2.起始:RNA聚合酶全酶促使局部双链解开,并催化ATP或GTP与另外一个三磷酸核苷聚合,形成第一个3',5'-磷酸二酯键。 3.延长:ζ因子从全酶上脱离,余下的核心酶继续沿DNA链移动,按照碱基互补原则,不断聚合RNA。 4.终止:RNA转录合成的终止机制有两种。 ⑴自动终止:模板DNA链在接近转录终止点处存在相连的富含GC和AT的区域,使RNA转录产物形成寡聚U及发夹形的二级结构,引起RNA聚合酶变构及移动停止,导致RNA转录的终止。 ⑵依赖辅助因子的终止:由终止因子(ρ蛋白)识别特异的终止信号,并促使RNA的释放。 四、真核生物RNA转录后的加工修饰: 1.mRNA的转录后加工: ⑴加帽:即在mRNA的5'-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内,即对HnRNA进行加帽。加工过程首先是在磷酸酶的作用下,将5'-端的磷酸基水解,然后再加上鸟苷三磷酸,形成GpppN的结构,再对G进行甲基化。 ⑵加尾:这一过程也是细胞核内完成,首先由核酸外切酶切去3'-端一些过剩的核苷酸,然后再加入polyA。 ⑶剪接:真核生物中的结构基因基本上都是断裂基因。结构基因中能够指导多肽链合成的编码顺序被称为外显子,而不能指导多肽链合成的非编码顺序就被称为内含子。真核生物HnRNA的剪接一般需snRNA参与构成的核蛋白体参加,通过形成套索状结构而将内含子切除掉。 ⑷内部甲基化:由甲基化酶催化,对某些碱基进行甲基化处理。 2.tRNA的转录后加工:主要加工方式是切断和碱基修饰。 3.rRNA的转录后加工:主要加工方式是切断。 第十二章蛋白质的生物合成 一、蛋白质生物合成体系: 生物体内的各种蛋白质都是生物体利用约20种氨基酸为原料自行合成的。蛋白质的生物合成过程,就是将DNA 传递给mRNA的遗传信息,再具体的解译为蛋白质中氨基酸排列顺序的过程,这一过程被称为翻译(translation)。参与蛋白质生物合成的各种因素构成了蛋白质合成体系,该体系包括: 1.mRNA:作为指导蛋白质生物合成的模板。 mRNA中每三个相邻的核苷酸组成三联体,代表一个氨基酸的信息,此三联体就称为密码。共有64种不同的密码。遗传密码具有以下特点:①连续性;②简并性;③通用性;④方向性;⑤摆动性;⑥起始密码: AUG;终止密码:UAA、UAG、UGA。 2.tRNA:在氨基酸tRNA合成酶催化下,特定的tRNA可与相应的氨基酸结合,生成氨基酰tRNA,从而携带氨基酸参与蛋白质的生物合成。 tRNA反密码环中部的三个核苷酸构成三联体,可以识别mRNA上相应的密码,此三联体就称为反密码。反密码对密码的识别,通常也是根据碱基互补原则,即A—U,G—C配对。但反密码的第一个核苷酸与第三核苷酸之间的配对,并不严格遵循碱基互补原则,这种配对称为不稳定配对。 能够识别mRNA中5′端起动密码AUG的tRNA称为起动tRNA。在原核生物中,起动tRNA是tRNAfmet;而在真核生物中,起动tRNA是tRNAmet。 3.rRNA和核蛋白体:原核生物中的核蛋白体大小为70S,可分为30S小亚基和50S大亚基。真核生物中的核蛋白体大小为80S,也分为40S小亚基和60S大亚基。核蛋白体的大、小亚基分别有不同的功能: ⑴小亚基:可与mRNA、GTP和起动tRNA结合。 ⑵大亚基:①具有两个不同的tRNA结合点。A位——受位或氨酰基位,可与新进入的氨基酰tRNA结合;P 位——给位或肽酰基位,可与延伸中的肽酰基tRNA结合。②具有转肽酶活性。 在蛋白质生物合成过程中,常常由若干核蛋白体结合在同一mRNA分子上,同时进行翻译。由若干核蛋白体结合在一条mRNA上同时进行多肽链的翻译所形成的念球状结构称为多核蛋白体。 4.起动因子(IF):这是一些与多肽链合成起动有关的蛋白因子。原核生物中存在3种起动因子,分别称为IF1-3。在真核生物中存在9种起动因子(eIF)。其作用主要是促进核蛋白体小亚基与起动tRNA及模板mRNA结合。 5.延长因子(EF):原核生物中存在3种延长因子(EFTU,EFTS,EFG),真核生物中存在2种(EF1,EF2)。其作用主要促使氨基酰tRNA进入核蛋白的受体,并可促进移位过程。 6.释放因子(RF):原核生物中有4种,在真核生物中只有1种。其主要作用是识别终止密码,协助多肽链的释放。 7.氨基酰tRNA合成酶:该酶存在于胞液中,与特异氨基酸的活化以及氨基酰tRNA的合成有关。每种氨基酰tRNA合成酶对相应氨基酸以及携带氨基酸的数种tRNA具有高度特异性。 二、蛋白质生物合成过程: 1.氨基酸的活化与搬运:氨基酸的活化以及活化氨基酸与tRNA的结合,均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。反应完成后,特异的tRNA3’端CCA上的2’或3’位自由羟基与相应的活化氨基酸以酯键相连接,形成氨基酰tRNA。 2.活化氨基酸的缩合——核蛋白体循环:活化氨基酸在核蛋白体上反复翻译mRNA上的密码并缩合生成多肽链的循环反应过程,称为核蛋白体循环。核蛋白体循环过程可分为三个阶段: ⑴起动阶段:①30S起动复合物的形成。在IF促进下,30S小亚基与mRNA的起动部位,起动tRNA(tRNAfmet),和GTP结合,形成复合体。②70S起动前复合体的形成。IF3从30S起动复合体上脱落,50S大亚基与复合体结合,形成70S起动前复合体。③70S起动复合体的形成。GTP被水解,IF1和IF2从复合物上脱落。 ⑵肽链延长阶段:①进位:与mRNA下一个密码相对应的氨基酰tRNA进入核蛋白体的受位。此步骤需GTP, Mg2+,和EF参与。②成肽:在转肽酶的催化下,将给位上的tRNA所携带的甲酰蛋氨酰基或肽酰基转移到受位上的氨基酰tRNA上,与其α-氨基缩合形成肽键。给位上已失去蛋氨酰基或肽酰基的tRNA从核蛋白上脱落。 ③移位:核蛋白体向mRNA的3'- 端滑动相当于一个密码的距离,同时使肽酰基tRNA从受体移到给位。此步骤需EF(EFG)、GTP和Mg2+参与。此时,核蛋白体的受位留空,与下一个密码相对应的氨基酰tRNA即可再进入,重复以上循环过程,使多肽链不断延长。 ⑶肽链终止阶段:核蛋白体沿mRNA链滑动,不断使多肽链延长,直到终止信号进入受位。①识别:RF识别终止密码,进入核蛋白体的受位。②水解:RF使转肽酶变为水解酶,多肽链与tRNA之间的酯键被水解,多肽链释放。③解离:通过水解GTP,使核蛋白体与mRNA分离,tRNA、RF脱落,核蛋白体解离为大、小亚基。 三、多肽链合成后的加工修饰: 1.一级结构的加工修饰: ⑴N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除:N端甲酰蛋氨酸是多肽链合成的起始氨基酸,必须在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除。其过程是:①去甲酰化;②去蛋氨酰基。 ⑵氨基酸的修饰:由专一性的酶催化进行修饰,包括糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等。 ⑶二硫键的形成:由专一性的氧化酶催化,将-SH氧化为-S-S-。 ⑷肽段的切除:由专一性的蛋白酶催化,将部分肽段切除。 2.高级结构的形成: ⑴构象的形成:在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协助下,形成特定的空间构象。 ⑵亚基的聚合。 ⑶辅基的连接。 3.靶向输送:蛋白质合成后,定向地被输送到其执行功能的场所称为靶向输送。大多数情况下,被输送的蛋白质分子需穿过膜性结构,才能到达特定的地点。因此,在这些蛋白质分子的氨基端,一般都带有一段疏水的肽段,称为信号肽。分泌型蛋白质的定向输送,就是靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子(SRP)识别并特异结合,然后再通过SRP与膜上的对接蛋白(DP)识别并结合后,将所携带的蛋白质送出细胞。 第十三章基因表达调控 一、基因表达调控基本概念与原理: 1.基因表达的概念:基因表达(gene expression)就是指在一定调节因素的作用下,DNA分子上特定的基因被激活并转录生成特定的RNA,或由此引起特异性蛋白质合成的过程。 2.基因表达的时间性及空间性: ⑴时间特异性:基因表达的时间特异性(temporal specificity)是指特定基因的表达严格按照特定的时间顺序发生,以适应细胞或个体特定分化、发育阶段的需要。故又称为阶段特异性。 ⑵空间特异性:基因表达的空间特异性(spatial specificity)是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段,同一基因的表达在不同的细胞或组织器官不同,从而导致特异性的蛋白质分布于不同的细胞或组织器官。故又称为细胞特异性或组织特异性。 3.基因表达的方式: ⑴组成性表达:组成性基因表达(constitutive gene expression)是指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达。其基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的,且较少受环境因素的影响。这类基因通常被称为管家基因(housekeeping gene)。 ⑵诱导和阻遏表达:诱导表达(induction)是指在特定环境因素刺激下,基因被激活,从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。阻遏表达(repression)是指在特定环境因素刺激下,基因被抑制,从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。 4.基因表达的生物学意义:①适应环境、维持生长和增殖。②维持个体发育与分化。 5.基因表达调控的基本原理: ⑴基因表达的多级调控:基因表达调控可见于从基因激活到蛋白质生物合成的各个阶段,因此基因表达的调控可分为转录水平(基因激活及转录起始),转录后水平(加工及转运),翻译水平及翻译后水平,但以转录水平的基因表达调控最重要。 ⑵基因转录激活调节基本要素:①顺式作用元件:顺式作用元件(cis-acting element)又称分子内作用元件,指 存在于DNA分子上的一些与基因转录调控有关的特殊顺序。②反式作用因子:反式作用因子(trans-acting factor)又称为分子间作用因子,指一些与基因表达调控有关的蛋白质因子。反式作用因子与顺式作用元件之间的共同作用,才能够达到对特定基因进行调控的目的。③顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用:大多数调节蛋白在与DNA结合之前,需先通过蛋白质-蛋白质相互作用,形成二聚体或多聚体,然后再通过识别特定的顺式作用元件,而与DNA分子结合。这种结合通常是非共价键结合。 二、操纵子的结构与功能: 在原核生物中,若干结构基因可串联在一起,其表达受到同一调控系统的调控,这种基因的组织形式称为操纵子。典型的操纵子可分为控制区和信息区两部分。信息区由一个或数个结构基因串联在一起组成;控制区通常由调节基因(阻抑蛋白编码基因)、启动基因(CRP和RNA聚合酶结合区)和操纵基因(阻抑蛋白结合位点)构成。 1.原核生物乳糖操纵子: 原核生物乳糖操纵子(Lac operon)的控制区包括调节基因,启动基因(其CRP结合位点位于RNA聚合酶结合位点上游)和操纵基因;其信息区由β-半乳糖苷酶基因(lacZ),通透酶基因(lacY)和乙酰化酶基因(lacA)串联在一起构成。当培养基中乳糖浓度升高而葡萄糖浓度降低时,乳糖作为诱导剂与阻抑蛋白结合,促使阻抑蛋白与操纵基因分离;另一方面,细胞中cAMP浓度升高,cAMP与CRP结合并使之激活,CRP与启动基因结合并促使RNA聚合酶与启动基因结合,基因转录激活。 2.原核生物色氨酸操纵子: 色氨酸操纵子(trp operon)属于阻遏型操纵子,主要调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。色氨酸操纵子通常处于开放状态,其辅阻遏蛋白不能与操纵基因结合而阻遏转录。而当色氨酸合成过多时,色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白,后者与操纵基因结合而使基因转录关闭。色氨酸操纵子的调控还涉及转录衰减(attenuation)机制。即在色氨酸操纵子第一个结构基因与启动基因之间存在有一衰减区域,当细胞内色氨酸酸浓度很高时,通过与转录相偶联的翻译过程,形成一个衰减子结构,使RNA聚合酶从DNA 上脱落,导致转录终止。 3.原核生物转录的整体调控模式: 由成群的操纵子组成的基因转录调控网络称为调节子。通过组成调节子调控网络,对若干操纵子及若干蛋白质的合成进行协同调控,从而达到整体调控的目的。典型的整体调控模式是SOS反应,这是由一组与DNA损伤修复有关的酶和蛋白质基因组成。在正常情况下,这些基因均被LexA阻遏蛋白封闭。当有紫外线照射时,细菌体内的RecA蛋白水解酶被激活,催化LexA阻遏蛋白裂解失活,从而导致与DNA损伤修复有关的基因表达。 三、真核基因组结构特点: 1.转录产物为单顺反子:真核基因的转录产物一般是单顺反子(mono-cistron),即一个编码基因转录生成一个mRNA分子,并指导翻译一条多肽链。 2.大量重复序列:真核基因组中含大量的重复序列,这些重复序列大部分是没有特定生物学功能的DN**段,可占整个基因组DNA的90%。根据重复频率可将其分为高度重复序列、中度重复序列和单拷贝序列。 3.断裂基因:真核生物中的基因具有不连续性,即一个基因的编码序列往往被一些非编码序列分隔开。基因中能够转录并进一步编码多肽链合成的部分称为外显子(exon),而在转录后会被剪除的部分则称为内含子(intron)。 三、真核基因表达调控的特点: 1.RNA聚合酶活性受转录因子调控:真核生物中存在RNA polⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种不同的RNA聚合酶,分别负责转录不同的RNA。这些RNA聚合酶与相应的转录因子形成复合体,从而激活或抑制该酶的催化活性。 2.染色质结构改变参与基因表达的调控:真核生物DNA与组蛋白结合并形成核小体的结构,再进一步形成染色质。当真核基因被激活时,染色质的结构也随之发生改变。主要的改变有: ⑴单链DNA形成:基因被激活后,双链DNA解开成单链以利于转录,从而形成一些对DNAaseⅠ的超敏位点。 ⑵DNA拓朴结构改变:天然双链DNA均以负性超螺旋构象存在,当基因激活后,则转录区前方的DNA拓朴结构变为正性超螺旋。正性超螺旋可阻碍核小体形成,并促进组蛋白解聚。 ⑶核小体不稳定性增加:由于组蛋白修饰状态改变,巯基暴露等原因而引起核小体结构改变。 4.正性调节占主导:真核基因一般都处于阻遏状态,RNA聚合酶对启动子的亲和力很低。通过利用各种转录因子正性激活RNA聚合酶是真核基因调控的主要机制。 5.转录和翻译过程分别进行:转录与翻译过程分别存在于不同的亚细胞部位,可分别进行调控。 6.转录后加工修饰过程复杂:特别是mRNA,转录后仅形成其初级转录产物——HnRNA,然后再经剪接、加帽、加尾等加工修饰,才能转变为成熟的mRNA。 四、真核基因转录调控元件及激活机制: 1.顺式作用元件(分子内作用元件): ⑴启动子:存在于结构基因上游,与基因转录启动有关的一段特殊DNA顺序称为启动子。与原核生物类似,也含有一段富含TATA的顺序,称为TATA盒。除此之外,还可见CAAT盒和GC盒。 ⑵增强子:位于结构基因附近,能够增强该基因转录活性的一段DNA顺序称为增强子。增强子的特点是:①在转录起始点5’或3’侧均能起作用;②相对于启动子的任一指向均能起作用;③发挥作用与受控基因的远近距离相对无关;④对异源性启动子也能发挥作用;⑤通常具有一些短的重复顺序。 ⑶沉默子:能够对基因转录起阻遏作用的DN**段,属于负性调控元件。 2.反式作用因子(分子间作用因子):真核生物反式作用因子通常属于转录因子(transcription factor,TF)。(1)转录因子的种类:①非特异性转录因子(基本转录因子):非选择性调控基因转录表达的蛋白质因子称为非特异性转录因子。真核生物中存在的三种RNA聚合酶分别有相应的转录因子,即TFⅠ,TFⅡ,TFⅢ。其中, TFⅡ一共有六种亚类。TFⅡD是唯一能识别启动子TA TA盒并与之结合的转录因子,而TFⅡB则可促进聚合酶Ⅱ与启动子的结合。②特异性转录因子:能够选择性调控某种或某些基因转录表达的蛋白质因子称为特异性转录因子。目前较清楚的是调控免疫球蛋白基因表达的核内蛋白质因子(NF)。 (2)转录因子的结构:反式作用因子至少含有三个功能域,即DNA结合功能域,转录活性功能域和其它转录因子结合功能域。DNA结合功能域带共性的结构主要有:①HTH和HLH结构:由两段α-螺旋夹一段β-折迭构成,α-螺旋与β-折迭之间通过β-转角或成环连接,即螺旋-转角-螺旋结构和螺旋-环-螺旋结构。②锌指结构:见于TFⅢA和类固醇激素受体中,由一段富含半胱氨酸的多肽链构成。每四个半光氨酸残基或His残基螯合一分子Zn2+,其余约12-13个残基则呈指样突出,刚好能嵌入DNA双螺旋的大沟中而与之相结合。③亮氨酸拉链结构:见于真核生物DNA结合蛋白的C端,与癌基因表达调控有关。由两段α-螺旋平行排列构成,其α-螺旋中存在每隔7个残基规律性排列的Leu残基,Leu侧链交替排列而呈拉链状。两条肽链呈钳状与DNA相结合。 ⑶转录因子的作用特点:①同一DNA顺式作用元件可被不同的转录因子所识别;②同一转录因子也可识别不同的DNA顺式作用元件;③TF与TF之间存在相互作用;④当TF与TF,TF与DNA结合时,可导致构象改变;⑤TF在合成过程中,有较大的可变性和可塑性。 3.转录激活及其调控:真核RNA聚合酶Ⅱ的激活需要依赖多种转录因子,并与之形成复合体。其过程首先是由TFⅡD识别启动子序列并与之结合;继而RNA聚合酶Ⅱ与TFⅡD、B等聚合形成一个功能性的前起始复合体——PIC;最后,结合了增强子的转录因子与前起始复合体结合,从而形成稳定的转录起始复合体。 第十四章基因重组和基因工程 一、自然界的基因转移和重组: 基因重组(gene recombination)是指DN**段在细胞内、细胞间,甚至在不同物种之间进行交换,交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。 1.接合作用:当细胞与细胞相互接触时,DNA分子即从一个细胞向另一个细胞转移,这种遗传物质的转移方式称为接合作用(conjugation)。 2.转化和转染:由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内,也可引起细菌遗传性状的改变。通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞,并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。转染是转化的一种特殊形式。 3.整合和转导:外来DNA侵入宿主细胞,并与宿主细胞DNA进行重组,成为宿主细胞DNA的一部分,这一过程称为整合。整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA,可以被切离出来,同时也可带走一部分的宿主 DNA,这一过程称为转导(transduction)。来源于宿主DNA的基因称为转导基因。 4.转座:转座又称为转位(transposition),是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位 置的现象。这些能够在基因组中自由游动的DN**段包括插入序列和转座子两种类型。 ⑴插入序列:典型的插入序列(insertion sequence,IS)是长750-1500bp的DN**段,由两个分离的反向重复序列和一个转座酶基因。当转座酶基因表达时,即可引起该序列的转座。其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。 ⑵转座子:转座子(transposons)是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列,含两个反向重复序列、一个转座酶基因和其他基因(如抗生素抗性基因)。 免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因(VH)和一组恒定区基因(CH)构成,通过这些基因的选择性转座和重组,就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链,以对付不同的抗原。 5.基因重组的方式: ⑴位点特异性重组:在整合酶的催化下,两段DNA序列的特异的位点处发生整合并共价连接,称为位点特异性重组。 ⑵同源重组:发生在同源DNA序列之间的重组称为同源重组(homologous recombination)。这种重组方式要求两段DNA序列类似,并在特定的重组蛋白或酶的作用下完成。 二、重组DNA技术: 重组DNA技术又称为基因工程(genetic engineering)或分子克隆(molecular cloning),是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组,并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。 1.载体和目的基因的分离(分):对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化,得到其纯品。 ⑴载体:常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建,除去致病基因,并赋予一些新的功能,如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。①质粒:是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA,具有独立复制的能力,通常带有细菌的抗药基因。②噬菌体:可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体,当目的基因与噬菌体DNA进行重组时,可采用插入重组方式,也可采用置换重组方式。③病毒:常用的为SV40,通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。 ⑵目的基因:①直接从染色体DNA中分离:仅适用于原核生物基因的分离。②人工合成:根据已知多肽链的氨基酸顺序,利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。③从mRNA 合成cDNA:采用一定的方法钓取特定基因的mRNA,再通过逆转录酶催化合成其互补DNA(cDNA),除去RNA链后,再用DNA聚合酶合成其互补DNA链,从而得到双链DNA。④从基因文库中筛选:将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后,与载体DNA重组,再全部转化宿主细胞,得到含全部基因组DNA的种群,称为G文库(genomic DNA library)。将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA,然后转化宿主细胞,得到含全部表达基因的种群,称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。⑤利用PCR合成:如已知目的基因两端的序列,则可采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术,在体外合成目的基因。2.载体和目的基因的切断(切):通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease),简称限制酶,分别对载体DNA和目的基因进行切断,以便于重组。能够识别特定的碱基顺序并在特定的位点降解核酸的核酸内切酶称为限制酶。限制酶所识别的顺序往往为4-8个碱基对,且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。 3.载体和目的基因的重组(接):即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来,得到重新组合后的DNA 分子。 ⑴粘性末端连接法:载体与目的基因通过粘性末端进行互补粘合,再加入DNA连接酶,即可封闭其缺口,得到重组体。 ⑵人工接尾法:即同聚物加尾连接法。在末端核苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端,如载体上添加一段polyG,则可在目的基因上添加一段polyC,通过碱基互补进行粘合后,再由DNA 连接酶连接。 ⑶人工接头连接法:将人工连接器(即一段含有多种限制酶切点的DN**段)连接到载体和目的基因上,即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断,得到可以互补的粘性末端。 4.重组DNA的转化和扩增(转):将重组DNA导入宿主细胞进行增殖或表达。重组质粒可通过转化方式导入宿主细胞,λ噬菌体作为载体的重组体,则需通过转染方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。重组DNA导入宿主细胞后,即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。 5.重组DNA的筛选和鉴定(筛):对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。 ⑴根据重组体的表型进行筛选:对于带有抗药基因的质粒重组体,可采用插入灭活法进行筛选。 ⑵根据标志互补进行筛选:当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时,可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因,如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物,则 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 该细胞中带有重组体。 ⑶根据DNA限制酶谱进行分析:经过粗筛后的含重组体的细菌,还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。 ⑷用核酸杂交法进行分析鉴定:采用与目的基因部分互补的DN**段作为探针,与含有重组体的细菌菌落进行杂交,以确定重组体中带目的基因。 获得带目的基因的细菌后,可将其不断进行增殖,从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序,则目的基因还可转录表达合成蛋白质