[分光光度计的使用方法]紫外分光光度计的使用原理和方法

[分光光度计的使用 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ]紫外分光光度计的使用原理和方法 [分光光度计的使用方法]紫外分光光度计的 使用原理和方法 篇一 : 紫外分光光度计的使用原理和方法 紫外分光光度计的使用原理和方法 紫外-可见吸收光谱 朗伯-比耳定律 紫外-可见分光光度计 分析条件的选择 测定方法 在医学检验中的应用 紫外-可见分光光度法 它是利用物质的分子或离子对某一波 长范围的光的吸收作用，对物质进行定性 分析、定量分析及结构分析, 所依据的光 谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的 光而产生的吸收光谱。 按所吸收光的波长区域不同，分为紫外 分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外可见分光光度法。 紫外-可见分光光度法的特点: 1 与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和 操作都比较简单，费用少，分析速度快; 2 灵敏度高; 3 选择性好; 4 精密度和准确度较高; 5 用途广泛。 ?1. 紫外-可见吸收光谱 1. 物质对光的选择性吸收 物质对光的吸收是选择性的，利用 被测物质对某波长的光的吸收 来了解物 质的特性，这就是光谱法的基础。 通过测定被测物质对不同波长的光的吸 收强度，以波长为横坐标，吸光 度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范 围的吸收曲线。如图3-1; 在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长 λmax进行物质含量的测定。 2 有机化合物的紫外-可见吸收光谱 2.1 有机化合物的电子跃迁 与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三 种，即形成单键的σ电子、形成双键的π电 子以及未参与成键的n电子。 跃迁类型有:σ σ*、n σ* 、π π *、 n π * 四种。 饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ?σ*， n?σ* 跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区， 吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。 不饱合机化合物的电子跃迁类型为n?π*， π?π* 跃迁，吸收峰一般大于200nm。 生色团:是指分子中可以吸收光子而产生电 子跃迁的原子基团。人们通常将能吸收紫外、 可见光的原子团或结构系统定义为生色团。 见表3-1和3-2。 助色团:是指带有非键电子对的基团，如OH、-OR、-NHR、-SH、 -Cl、-Br、-I等， 它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当 它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰 向长波方向移动，并且增加其吸收强度。见 表3-4。 红移和紫移 在有机化合物中，常常因取代基的变更 或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸收波长 λmax发生移动。向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为紫移。 2.2 有机化合物的吸收带 吸收带: 在紫外光谱中，吸 收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分 子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。 R吸收带 K吸收带 B吸收带 E吸收带 3 无机化合物的紫外-可见吸收光谱 1. f电子跃迁吸收光谱 镧系和锕 系元素的离子对紫外和可见光的 吸收是基于内层f电子的跃 迁而产生的。其 紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰， 这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影 响。 2. d电子跃迁吸收光谱 过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨 道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰 强烈受配位环境的影响。 例如 cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm 处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。此 类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。 3. 电荷迁移光谱 某些分子既是电子给 体，又是电子受体，当电子受辐射能激发 从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生 较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。 如 苯酰基取代物在光作用下的异构反应。 1.4 影响紫外-可见吸收光谱的因素 物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。 测定条件不同， 吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度 等都可能发生变化。 1.温度 在室温范围内，温度对吸收光谱的影 响不大。 2. 溶剂 注意如下几点: 尽量选用低极性溶剂; 能很好地溶解被测物，并且形成的溶液 具有良好的化学和光化学稳定性; 溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。 3. pH值 1.5 紫外-可见吸收光谱的应用 紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量 分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、 结构分析。 1.定性分析 2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方 便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用 A280/A260的比值，鉴定其纯度。 3.结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物 的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化 合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定 价值。 例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说 明该物质无共轭结构和芳香结构。 ?2. 朗伯-比尔定律 一、吸光度和透光度 设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透 射光强度为 It，反射光强度为Ir，则 I0= Ia+ It+ Ir 由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵 消，上式可简化为: I0= Ia+ It 透光度:透光度为透过光的强度It与入射光 强度I0之比，用T表 示: 即 T= It/I0 吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示， 即 A=lg1/T=lgI0/It 二、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律:当一束平行单色光通过含有 吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光 物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 A= κ cl 式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光 波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l 为透光液层厚度。 朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的 理论基础。 三、吸光系数 当l以cm，c以g/L为单位，κ称为吸光 系数，用 a 表示。 A= a cl a的单位为L/ 摩尔吸光系数 当l以cm，c以mol/L为单位，κ称为摩尔 吸光系数，用 ε表示。 ε的单位为L/mol.cm，它表示物质的浓度 为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光 度。 比吸光系数 比吸光系数是指百分含量为1%， l为1cm 1% 时的吸光度值，用 E1cm 表示。 ? ? 0.1M r E 1% 1cm 四、偏离朗伯-比耳定律的因素 入射光为非单色光 溶液的不均性。 实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸 馏水中的微生物，存在散射以及共振发射 等，均可吸光质点的吸光特性变化大。 光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长度不一 致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均 造成光径不一致，从而与定律偏离。 ?3. 紫外-可见分光光度计 一、主要部件的性能与作用 基本结构: 光源?单色器?吸收池?检测器?信号显示系统 ? 样品 1 光源 在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类:热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯;气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。 2 单色器 单色器的主要组成:入射狭缝、出射狭 缝、色散元件和准直镜等部分。 单色器质量的优劣，主要决定于 色散元件的质量。色散元件常用棱镜 和光栅。 3 吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯，按材 料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前 者不能用于紫外区。 吸收池的种类很多，其光径可在 0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池 最为常用。 4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光 信号转变为电信号。现今使用的分光光度 计大多采用光电管或光电倍增管作为检测 器。 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计， 电位调节指零装置，以及自动记录和数 字显示装置等。 5 二、紫外-可见分光光度计的类型 按其光学系统可分为单波长分光光 度计和双波长分光光度计。 1.单波长单光束分光光度计 目前国内广泛采用721型分光光度计。 具有结构简单、价格低廉、操作方便、 维修也比较容易，适用于常规分析。 单波长单光束分光光度计还有国产 751型、XG-125型、英国SP500型和伯 克曼DU-8型等。 2.单波长双光束分光光度计 单波长双光束分光光度计有国产710型、 730型、740型、日立UV-340型等就属于这 种类型。 3.双波长分光光度计 双波长分光光度计的优点:是可以在有 背景干忧或共存组分吸收干忧的情况下 对某组分进行定量测定。 国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、 UV-265型等。 三、分光光度计的校正和检验 1.波长校正 2.吸光度校正 3.杂散光的检验 4.稳定性的检验 ?4 分析条件的选择 一、 仪器测量条件的选 择 1.适宜的吸光度范围 由朗伯-比尔定律可知: A=lg1/T=εcl 微分后得: dlgT=0.4343dT/T= -εldc 或 0.4343ΔT/T= -εlΔc 代入朗伯-比尔定律有: Δc/c=0.4343ΔT/TlgT 要使测定的相对误差Δc/c最小，求导取极 小得出: lgT=-0.4343=A 即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小。 最适宜的测量范围为0.2~0.8之间。 2.入射光波长的选择 通常是根据被测组分的吸收光谱，选择 最强吸收带的最大吸收波长为入射波长。当 最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸 收稍低，峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测 定。 3( 狭缝宽度的选择 为了选择合适的狭缝宽度，应以减少 狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。 一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半 宽度的十分之一。 二、显色反应条件的选择 对多种物质进行测定，常利用显色反 应将被测组分转变为在一定波长范围有吸 收的物质。常见的显色反应有配位反应、 氧化还原反应等。 这些显色反应，必须满足以下条件: 1(反应的生成物必须在紫外-可见光区有较 强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大; 2(反应有较高的选择性，即被测组分生成 的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱 有明显的差别; 3. 反应生成 的产物有足够的稳定性，以保 证测量过程中溶液的吸光度不变; 4.反应生成物的组成恒定。 1(酸度 显色反应最适宜的酸度范围可通过实 验来确定:测定某一固定浓度的试样的吸 光度随酸度的变化，以吸光度为纵坐标， 溶液的PH值为横坐标作图。 2.显色剂的用量 3.显色时间和温度 三、参比溶液的选择 测定试样溶液的吸光度，需先用参比 溶液调节透光度为100%，以 消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反 射和吸收带来的测定误差。 参比溶液的选择视分析体系而定，具体有: 1(溶剂参比 试样简单、共存其它成分 对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸 收池等因素; 2(试样参比 如果试样基体溶液在测定 波长有吸收，而显色剂不与试样基体显 色时，可按与显色反应相同的条件处理 试样，只是不加入显色剂。 3(试剂参比 如果显色剂或其它试剂在 测定波长有吸收，按显色反应相同的条件， 不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参 比溶液。 4. 平行操作参比 用不含被测组分的试 样，在相同的条件下与被测试样同时进 行处理，由此得到平行操作参比溶液。 ?5 测定方法 一、 单组分定量方法 单组分是指样品溶液中含有一种组分， 或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰 与其他共有物质的吸收峰无重叠。 其定量方法包括校准曲线法、 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 对比 法和吸收系数法。 1 校准曲线法 方法: 配制一系列不同含量的标准溶液，选 用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列 标准溶液的吸光度，作A-c曲线，即标准曲 线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方 程。 在相同条件下测定未知试样的吸光度， 从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试 样的浓度。 2 标准对比法 即将待测溶液与某一标样溶液，在相同 的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。 As=Kcs Ax=Kcx cs Ax cx ? As ?6 紫外-可见分光光度法在医学检验中的应用 例1.血清铜的测定 例2.新生儿血清胆红素的测定 篇二 : 分光光度计的使用方法 分光光度计的使用方法 主体 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 : 1(使用仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理。[]以及各个操作旋钮之功能。在未接通电源前，应该对仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固。通地要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再接通电源开关。仪器在使用前先检查一下， 放大器暗盒的硅胶干燥筒，如受潮变色，应更换干燥的蓝色硅胶或者倒出原硅胶，烘干后再用。 2(将灵敏度旋钮调置“1”档。 3(开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调至测试用波长。仪器预热20分钟。 4(打开试样室盖，调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”，盖上试样室盖，将比色皿架置与蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”。 5(如果显示不到“100.0”，则可适当增加微电流放大器的倍率档数，但尽可能置低倍率档使用，这样仪器将有更高的稳定性。但改变倍率后必须按重新校正“0”和“100%”。 6(预热后，按连续几次调整“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。 7(吸光度A的测量按调整仪器的“00.0”和“100%”，将选择开关置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。 8(浓度C的测量:选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，即可读出被测样品的浓度值。 9(如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100%”后稍等片刻，，当稳定后，重新调整“0”和“100%”即可工作。 10(每台仪器所配套的比色皿，不能与其它仪器上的比色皿单 个调换。 11(本仪器数字表后盖，有信号输出0,1000MV，插座1脚为正，2脚为负接地线。 吸收池使用注意事项: ? 要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1,洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净， 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。 ? 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。[]严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 ? 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。 ? 吸收池的校正:要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度“A0”，样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”，则校正后的实际吸光度A为:A= A1,A0 1. 分光光度法定义与应用 1.1 定义: 分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术. 1.2 特点: 灵敏,精确,快速和简便,在复杂组分系统中,不需要分离,即能检测出其中所含的极少量物质. 1.3 应用: 生物化学研究中广泛使用的方法之一,广泛用于糖, 蛋白质,核酸,酶等的快速定量检测. 2. 分光光度计的基本结构和工作原理 2.1 分光光度计的分类 分光光度计的分类 红外分光光度计: 测定波长范围为大于760 nm的红外光区 可见光分光光度计: 测定波长范围为400~760 nm的可见光区 紫外分光光度计: 测定波长范围为200,400 nm的紫外光区 2.2 分光光度计工作原理 人眼可见的光只占电磁波谱的很小—部分，它是一种频率较大的电磁波.电磁波按频率大小,从频率最小的无线电波到频率最大的γ-射线排成一列,即组成电磁波的波谱,如下图所示. 2.2.1 分光光度计的光谱范围 包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200,400 nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源. 钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400,760nm波长的光谱,光通过三棱镜折射后,可得到由红,橙,黄,绿,蓝,靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源. 氢灯的发射光谱:氢灯能发出185,400 nm波长的光谱,可作为紫外光光度计的光源. 2.2.2 物质的吸收光谱 如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显 示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱. 不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质. 2.2.2 物质的吸收光谱 当光线通过某种物质的溶液时,透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收,只有一部分光可透过溶液. 入射光 = 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透过光 如果我们用蒸馏水作为”空白”去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失,则: 入射光 = 吸收光 十 透过光 2.2.3 物质吸光度与透射比的关系 设 I0 为经过空白校正后入射光的强度;I 为透过光的强度. 根据实验得知 I = I0 ?10-εc l 式中,c 表示吸收物质的摩尔浓度;l 表示吸收物质的光径,用cm表示;ε表示吸收物质的摩尔消光系数,它表示物质对光的吸收特性,不同物质的ε数值不同. 所以 I / I0 = 10-εc l 令 T = I / I 0 T = 10-εcl 若以T对吸收物质的浓度作图,则得图1-5-2中的曲线. 由上式可得 1g = εc l lg为物质的吸光度 A = 1g 2.2.4 Lambert -Beer定律 上式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比,这就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer定律. 2.3 分光光度计的基本结构 无论哪一类分光光度计都包括 :光源,单色器,吸收池,检测器和测量仪表.分光光度计各部件的次序如图所示: 5个基本部件 分光光度计的基本部件: 光源: 分光光度计上常用的光源有两种:钨丝灯或氢灯,在可见光区,近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源;在紫外光区多使用氢弧灯. 单色器:把混合光波分解为单—波长光的装置.在分光光度计中多用 作为色散元件. 吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用来盛被测的溶液.在低于350 nm的紫外光区工作时,必须采用石英池或熔凝石英池. 分光光度计的基本部件: 吸收池必须与光束方向垂直.此外,每套比色皿的质料,厚度应完全相同,以免产生误差.比色皿上的指纹,油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性,因此在使用前务必彻底清洗. 常用光电池,光电管和光电倍增管三种. 测量装置:—般常用的紫外光和可见光分光光度计有3种测量装置,即电流表,记录器和数字示值读数单元.现代的仪器常附有自动记录器,可自动描出吸收曲线. 检测器 棱镜与光栅 棱 镜: 光波通过棱镜时,不同波长的光折射率不同;因而能将不同波长的光分开.玻璃对紫外线的吸收力强,故玻璃棱镜多用于可见光分光光度计.石英棱镜可在整个紫外光区传播光,故在紫外光分光光度计中广为应用. 衍射光栅: 在石英或玻璃表面上刻划许多平行线.由于刻线处不透光,通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大,较短的光波偏折角度小,因而形成光谱. 棱镜单色器装置示意图 光源照到棱镜以前,先要经过一个入射狭缝,再通过平行光镜使成为平行光束投到棱镜上.透过棱镜的光再经另一聚光镜,在此聚光镜的焦面内可得一清 楚的光谱图.如在焦线处放—出射狭缝,转动棱镜使光谱移动,就可以从出射狭缝射出所需要的单色光.整个装置称为”单色器” 检测器---光电池 光电池:装在一个特制的匣子里面由3层物质组成的圆形或长方形薄片.第一层是一种导电性良好的金属，这是光电池的负极。[) 中间极薄的一层是半导体硒,第3层是铁，这 是光电池的正极.当光电池受光照射以后,半导体硒的表面逸出电子,这些电子只向负极方向移动,而不向正极移动,因此在上下两金属片间产生一个电位差,线路 连通时即产生电流 检测器---光电管 光电管:光电管是由封装在真空透明封套里的一个半圆柱型阴极和一个丝阳极组成.阴极的凹画上有一层光电发射材料,此种物质经光照射可发射电子.当在两极间加有电位 时,发射出来的电子就流向丝阳极而产生光电流.对于相同的辐射强度,它所产生的电流约为光电池所产生电流的1/4.由于光电管具有很高的电阻,所以产生的电流容易放大 . 检测器---光电倍增管 光电倍增管:它比普通的光电管优越,它可将第一次发射出的电子数目放大到数百万倍.当电子打在兼性阳极上时,能引起更多的电子自表面射出.这些射出的电子又被第二个兼性阳极所吸引,同样再产生更多的电子. 此过程重复9次后,每个光子可形成106~107个电子.这些电子最后被收集在阳极上.所得到的倍增电流可进一步加以放大和测量. 2.4 分光光度法的测量误差 分光光度法的测量误差 选择适宜波长的入射光 控制吸光度A的遍数范围 选择适当的参比溶液 仪器测 量误差 测量条 件选择 2.4.1 仪器测量误差 由朗伯-比尔定律可知,只有在一定的浓度范围内,即一定的吸光度范围同内,由分光光度计测量所引起的测定结果的相对误差才是较小的;当透光率接近0或 1.0时,其相对误差趋于无限大;一般在百分透光率在10~80%的范围内,浓度测量相对误差较小;对于精密度高的仪器.当吸度 A=0.7-0.2时选择适宜波长的入射光:由于有色物质对光有选择性吸收,为了使测定结果有较高的灵敏度,必须选择溶液最大吸收波长的入射光. 控制吸光度A的准确的读数范围:由朗伯-比耳定律可知,吸光度只有控制在0.2~0.7读数范围内时,测量的准确度较高. 选择参比溶液:参比溶液是用来调节仪器工作零点的.若样品溶液,试剂,显色剂无无色可用蒸馏水作参比溶液;反之应采用不加显色剂的样品液作参比溶液. 2.5 显色反应及其影响因素 显色反应及其影响因素 显色反应 一般要求 影响显色 反应因素 选择性好 灵敏度高 生成的有色化合物性质稳定 显色剂与有色物颜色反差大 显色反应要易于控制 显色剂用量 反应液的酸碱度 反应温度 显色反应时间 干扰离子的影响 2.5.1 显色反应一般要求 选择性好:显色剂最好只与一种被测组分起显色反应; 灵敏度高:灵敏度高有笪微量组分的测定; 有色化合物性质稳定:确保前后测定准确. 显色剂与有色物颜色反差大:两者最大吸收波长之差应大于 60nm; 显色反应要易于控制:结果的确保实验再现性. 2.5.2 影响显色反应的主要因素 显色剂用量:通过实验来确定最适用量; 反应液的酸碱度溶液酸碱度直接影响金属离子与显色剂存在 形式以及有色化合物组成的稳定性. 反应温度:不同的显色反应需要不同的反应温度,一般显色反应可在室温下完成. 显色反应时间:显色反应的速度有快有慢. 干扰离子的影响:应采用适当方法消除其影响. 3. 7200型分光光度计的正确使用方法 3.1 结构和工作原理 3.1.1 仪器结构 3.1.2 工作原理 3.1.3 特点 3.2 使用方法 3.3 注意事项 3.1.1 7200型分光光度计仪器结构 7200型光栅分光光度计由光源,单色器,试样室,光电管,线性运算放大器,对数运算放大器及数字显示器等部件组成,基本结构如下图所示. 1.光源;2.单色器;3.试样室;4.光电管;5.线性运算放大器;6.对数运算放大器;7.数字显示器 3.1.2 7200型分光光度计工作原理 7 2 0 0型光栅分光光度计光学系统示意图 1.光源灯;2.滤光片;3.球面反射镜;4.入射狭缝;5.保护玻璃;6.平面反射镜;7.准直镜;8.光栅;9.保护玻璃;10.出射狭缝; 11.聚光镜;12.试样室; 13.光门;14.光电管; 3.1.2 7200型分光光度计工作原理 由光源灯发出连续辐射光线,经滤光片和球面反射镜至单色器的入射狭缝聚焦成像,光束通过入射狭缝经平面反射镜到准直 镜产生平行光,射至光栅上色散后又以准直镜聚焦在出射狭缝上形成一连续光谱,由出射狭缝选择射出一定波长的单色光,经聚光镜 聚光后,通过试样室中的测试溶液部分吸收后,光经光门再照射到光电管上.调整仪器,使透光度为100%,再移动试样架拉 手,使同一单色光通过测试溶液后照射到光电管上.如果被测样品有光吸收现象,光量减弱,由光电转换元件将变化的光信号转变为电信号,经线性运算放大器和对 数运算放大器处理,将光能的变化程度通过数字显示器显示出来.可根据需要直接在数字显示器上读取透光度,吸光度或浓度. 3.1.3 特点 具有低杂色光,高分辩率的单光束光路结构的单色器; 具有良好的稳定性,重现性和精确的测量读数; 明亮清晰的数字显示器可显示透射比,吸光度,浓度和所设置的波长,提高了仪器的读数准确性; 采用最新微机处理技术,仪器具有自动设置0%T和100%等控制功能; 仪器配有标准的RS-232双向通讯接口,不仅可向计算机发送 测试参数,还可接收计算机发出的指令. 在已知标准溶液浓度前提下,测定未知样品浓度; 在已知标准溶液浓度斜率前提下,测定未知样品浓度. 4.1 紫外分光光度计法概述 4.1.1 定义 用紫外光源通过分光光度技术对物质进行测定的方法叫作紫外分光光度法.所使用的仪器叫作紫外分光光度计. 4.1.2 原理 因为许多化合物的分子结构中存在共轭双键,在200,400nm 的紫外光区具有吸收光的特性,所以无需进行显色反应便能直接测定. 4.1.3 应用 常用于对蛋白质和核酸进行定性,定量测定.蛋白质分子中所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基在波长280nm处具有最大吸收峰.故常用波长280nm处的吸光度测定蛋白质的浓度. 4.1.4 特点 组成核酸的碱基也含有共轭双键,其最大吸收峰的波长在260nm处.但在280nm处也有一定的光吸收,对蛋白质的测定有一定的干扰作用.若分别测定280nm和260nm处的吸光度,可通过经验公式消除核酸对蛋白质测定的影响. 可对微量蛋白质不需显色,进行直接定量测定.因此操作简便,而且可回收样品.此外,盐类在280nm处无光吸收,少量盐类也不会影响测定结果. 紫外分光光度法完全符合Lambert-Beer定律的基本原理.在其它条件保持一致的情况下,被测溶液的吸光度与被测溶液的浓度成正比. 4.2 UV-754型分光光度计的结构和工作原理 4.2.1 仪器结构 由光源,单色器,试样室,接受器,微电流放大器,A/C 转换器,打印机,键盘和显示器等部件组成.微处理机通过输入,输出口对微电流放大器,显示器和打印机等部件进行 控制,实现仪器的整体功能. 4.2.2 工作原理 UV-7 5 4型紫外-可见分光光度计光学系统示意图 1.氚灯;2.钨灯;3.滤光镜;4.聚光镜;5.入射狭缝;6.平面;7.准直镜; 8.光栅; 9.出射狭缝; 10.聚光镜; 11.试样室; 12.光门; 13.光电管 4.2.2 工作原理 由光源氚灯或钨灯发出连续辐射光线经滤光镜和聚光镜至单色器入射狭缝处聚焦成像,再经平面反射镜反射至准直镜产 生平行光射至光栅在光栅上色散后又经准直镜聚焦在出射狭缝上成一连续光谱,经出射狭缝射出的光在聚光镜聚光后分别通过试样室 中的空白溶液,标准溶液或样品溶液,被部分吸收后光经光门再照射到光电管 上.被光电管接收的光信号再被转换成电信 号,后者通过输入,输出口,见上图.进入微处理机进行调零,变换对数,浓度计算以及打印数据等处理,将检测结果通过显示器和打印系统显示出来. 4.3 UV-754型分光光度计使用方法 4.3.1 UV-754型紫外可见分光光度计的外观图 1.试样架拉手;2.键盘部分;3.数据打印;4.波长刻度盘; 5.波长手轮;6.电源汗关;7.氚灯触发按钮;8.光源室. 4.3 UV-754型分光光度计使用方法 UV-754型紫外-可见分光光度计的键盘示意图 键盘详细内容说明如下: 4.3 UV-754型分光光度计使用方法 ? 功能键: F1,F8,暂无功能,备扩展使用. ? T键: 具有三种透光度状态调节功能. ? A/C键:吸光度/浓度转换键,按此键可分别表示”吸光度0,3A”,”吸光度0,0.lA”,”吸光度0,0.1A”和”浓度”四种状态. ? 送入键:只在”A/C键”处于”浓度”状态时才起作用. ? 打印键:手动方式时有效,每按一次,便打印一次数据. ? 控制键:在分别使用”设定+”,”设定一”,”倍率”,”显示方式”和”打印方式”各键时,需与控制键分别联合使用才起作用. ? 设定+键:在”A/C键”处于”浓度”状态时才能设定”标准浓度值”,”斜率K值”或”斜率B值”等数据.其功能是将设定数值增加. 4.3 UV-754型分光光度计使用方法 ? 设定- 键:是使设定数值减小,操作与”设定+键”类同. ? 倍率键:用来设定标准溶液浓度的放大倍数.有”1”,”0.1”和”0.01”三档,与”控制键”同时按下,倍率便发生相应的变化. ? 显示方式键:可表示”积分”,”浓度”和”样品号”三种状态. 打印方式键:存在”自动”,”方式1”和”方式2”三种状态.每与”控制键”同时按一次此键便改变一个状态. 送纸键:每按一次此键,仪器移动一次打印纸. TAC:数字显示器显示测定结果或输入的数据. 4.3.2 UV-754型紫外可见分光光度计使用方法 测试准备 ? 将盛有”空白”或”对照”溶液的比色皿处于试样室光路位置; ? 选择波长 旋动波长手轮选定所需波长; ? 确定光源 波长在200,290nm时,选择氚灯为光源;波长在290,360nm时,同时以氚灯和钨灯为光源;波长在360,850nm时,选择钨灯为光源;若使用氚灯,需按氚灯触发按钮启动; ? 仪器自检 显示器显示”754”后,数字显示出现”100.0”,表明仪器通过自检程序,此时仪器进入”0,100%”,”连续”和”自动”状态 ? 仪器预热30min后方可进行测试. 4.3.2 UV-754型紫外可见分光光度计使用方法 测试过程 ? 数字显示透光度”100.0”2,3s后,将盛有标准溶液的比色皿移至光路,打印系统便自动打印出所得数据; ? 将盛有样品溶液的比色皿移至光路,打印系统即自动打印出该样品的数据.待第一个样品数据打印完毕后,将第二个样品置于试样 室光路………,若有多个样品,操作以此类推. 打印方式 采用”自动”方式打印,依所选定表达方式可打印出以下数据:No %T或ABS或CONC 4.4 UV—754型紫外—可见分光光度计注意事项 预热是保证实验结果准确可靠的必要 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 ,不可忽略. 在波长320nm以下的实验范围一定要选用石英比色皿,绝不可以玻璃比色皿替代. 比色皿需保持清洁,拿放时要符合要求. 对不同型号和类型的仪器要严格按照使用说明操作. UV-754型紫外-可见分光光度计还可开展”以校正线进行浓度演算”和”用已知斜率K值与B值进行浓度测定”等多种测试方法. 不同蛋白质所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸的数量有所差异,此法对不同蛋白质洋品的测定结果有所影响