植物DNA提取方法

黄瓜基因组DNA的提取：（SDS-CTAB法） Cucumber Genomic DNA Extracting 【实验目的】 【Experiment objective】 利用本法提取黄瓜基因组DNA To Extract gDNA of Cucumber 【实验原理】 【Experiment principle】 用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞膜；用细胞提取液抽提DNA；通过氯仿/异戊醇去除DNA提取液中的蛋白、糖、色素等污染物；用RNAse消化RNA；最后通过70%酒精沉淀获得纯化的DNA。 Grind leaf samples into fine powder in liquid nitrogen to break cell; with CTAB to isolate DNA; with chloroform: isoamyl alcohol (24:1) to get rid of protein, amylase and pigment et al.; RNAse digest RNA; with 70% alcohol to deposit DNA. 【仪器、材料、试剂】 【Apparatus, material and reagent】 (一)仪器    Apparatus 1. 低温离心机              Temperature regulated centrifuge 2. 恒温水浴锅              Constant temperature water bath 3. 电泳仪                  Electrophoresis apparatus 4. 凝胶成像系统            Gel imaging system (二) 材料    Material 1. 离心管                    Eppendorf tube 2. 研钵                      Mortar 3. 移液枪                    Removing liquid instrument 4. 枪头                      Tips (三)试剂   Reagent 1. 聚乙烯吡咯烷酮            PVP 2. 三羟甲氨基甲烷            Tris 3. 乙二胺四乙酸              EDTA 4. 氯化钠                    Nacl 5. 十二烷基磺酸钠            SDS 6. 十六烷基三甲基溴化胺      CTAB 7. в巯基乙醇                β-mercaptoethano 8. 异戊醇                    Isoamyl alcohol 9. 氯仿                      Chloroform 10. 异丙醇                    Isopropanol 11. 乙醇                      Alcohol 12. 琼脂糖                    Agarose ◆提取缓冲液：    100mmol/L          Tris-HCl （pH8.0） 50mmol/L            EDTA  （pH8.0） 1.0mol/L            NaCl 2％                SDS 2%                  PVP40 20uL~50uL/mL        β-巯基乙醇 （现用现加） ◆5% CTAB Buffer：  5%                CTAB ◆TE Buffer：          10mmol          Tris-Cl (pH8.0)                     1mmol          EDTA (pH8.0) 【实验步骤】 【 Protocal 】 1.取幼嫩的黄瓜叶片约4g于液氮中研磨，并将磨碎的叶片粉末放入预冷的2mL离心管中。加入900μL 在65℃水中预热的提取缓冲液，再加入20μLβ-巯基乙醇，振荡混匀，65℃水浴30min； Harvest young freshly opened cucumber leaves 4g ,grind leaf samples into fine powder in liquid nitrogen and put leaf-powder into pre-cooled 2mL tube.Add 900μL extraction buffer pre-warmed and 20μL β-mercaptoethanol into tubes， shaking violently,then bath at 65℃ for 30 min. 2. 加入1/3体积5mol/L KAc，冰浴30min~1hr（时间长了效果更好），4℃，12000rpm，离心10min； Add 1/3 volume 5mol/L KAC (about 300μL) and bath in ice for 0.5-1h(long time better ), centrifuge  for 10 min at 12000rpm(4℃). 3.取上清，加入1/5体积的5% CTAB Buffer，上下颠倒充分混匀，65℃水浴约20min； Draw up supernatant into new tube and add 1/5 volume 5% CTAB buffer, swirl in circular motions and bath at 65℃ for 20 min. 4.待冷却置窒温后，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提两次，室温11000rpm，离心5min，如界面浑浊再抽提一至两次； When solution is cooled to room temperature,add isovolumetric chloroform: isopentyl alcohol(24:1 V:V),swirl in circular motions and centrifuge for 5 min at 11000rpm(room tempeturate),repeat this step. 5.取上清至新的1.5mL离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒充分混匀，-20℃放置3h，12000rpm，离心10min； Take supernatant into 1.5mL tube and add 2/3 volume pre-cooled isopropanol,shake tube up-and –down and place it in -20℃ fridge for 3h, then centrifuge for 10 min at 12000rpm (4℃). (6)弃上清，用1mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀两次。抽干沉淀，加50-100ulTE溶解；加1/10体积RNase（10mg/ml）处理DNA样品，37℃ 30 min； Remove supernatant and wash the precipitate with 1mL pre-cooled 70% alcohol two times. Dry precipitate in cool air and dissolve it with 50-100μL TE.Treat the DNA sample with 1/10 volume Rnase(10mg/mL) for 30 min at 37℃ (7)加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，2倍体积无水乙醇混匀，-20℃放置10min， 4℃，6 000rpm，离心5min，用70%乙醇洗涤沉淀两次，抽干沉淀，加50-100μLTE buffer溶解，取2μl于1%琼脂糖凝胶中，100V，电泳30min，拍照，其余置-20℃保存或直接用于酶切。 Add 1/10 volume 3mol/L NaAC(PH 5.2) and 2 times volume anhydrous alcohol,place it at -20℃ fridge for 10 min. Centrifuge for 5 min at 6000rpm(4℃), remove supernatant and wash the precipitate with pre-cooled 70% alcohol two times. Dry precipitate in cool air and dissolve it with 50-100μL TE.Add 2μLDNA samples mixed with bromophenol blue into 1% agarose gel,100V, electrophoresis  for 30 min.Restore DNA at -20℃.