微水相脂肪酶催化乙酸甲基苯甲酯立体选择性氨解反应

微水相脂肪酶催化乙酸甲基苯甲酯立体选择性氨解反应 微水相脂肪酶催化乙酸甲基苯甲酯立体选 择性氨解反应 微生物学通报2001年28(6) 微水相脂肪酶催化乙酸甲基苯甲酯立体选择性氨解反应 李慧青宗敏华砍粱文峰 (华南删ll^学牛l物I:系广州5】0640 摘要:从4种不同来源的脂肪酶,2种不同来源的蛋白酶中筛选出r具有较高性和对映 体选择性的能催化乙酸甲基苯甲酯氨解反应的脂肪酶Novozym435进一步探讨了氯谅, 酶浓度,底物浓度等因素对该酶反应的影响.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明.在优化豢件下,氯解反应6h.转 化率为51.6%,残留底物中()一乙酸甲基苯甲酯埘映体过剩值可达99%以七一 关键词:微求相,脂肪酶,乙酸甲基苯甲酯,立体选择性氨解 中图分类号:Q939124文献 标识 采样口标识规范化 下载危险废物标识 下载医疗器械外包装标识图下载科目一标识图大全免费下载产品包装标识下载 码:A文章编号:09.253—2654(2001)06-0040-05 LIPASE-CATALYZEDAMMONOLYS1SOF(?)一 ACETATEINMICROAQUEOUSPHASE L1Hui—Qi.gZONGMin-HuaIEHttanLIANGWenFeng (Bioteehnatogydepartmetzt,S~~th(Y~a'naUni*~.ityofTa-hnology.Guang=)u~u510640 )s响t:Nox,oz)Ta435wselectedfromfourlipa~esandtwop瓜?becat~eofhcactlvand enanfiosectivityForther??|ofc?j—methyJbenzytmeI]heeffectofammomaSOLR'O~4,lhe?一 ce~tmlionofe【lz??eandsubs~trates0口there.~fionmfllIt~t"exp[~redunderffaeoptl/l/umcx~nditionsofthis study.after6hrezctkm,wilhtheen~lmmericexce~of山er~aning(-j一0一methyIbenzylaodmev,-asfotmdtobe Hgt时than99% Keyrds:Micr0锢ueouphase./3pa~,(?j—o—Ivlethy[benzylltoetate.Stet~oselectivearmnonolysis 脂肪酶(EC3.I1.3)是能与底物形成酰酶中问体,催化酯的水解,酯化和转酯反 应的酶类.8o年代后期以来,界面酶学和非水相酶学的研究与应用取得突破性进展, 极大地促进了脂肪酶多功能催化作用的开发.脂肪酶具有宽广的底物专一性,在有机 相中具有较高的稳定性和立体选择性,能催化多种类型的反应,包括以许多非天然的 酰基受体,如乙醇,酰胺,胺和过氧化物为底物的反应?.近来发现氨电可作为酰 基受体,如辛酸乙酯能在脂肪酶的催化作用下发生氢解反应,牛成相应的酰胺.酰 胺具有良好的乳化作用,生物相容性及抗微生物的能力,因此广泛应用于化妆品,生 活用品,食品和药物上,还可作为工业去垢剂,家用清洁剂等;与传统在高温高压下 用脂肪酸或其甲酯酰胺化生产酰胺相比,酶促反应具有条件温和,专一性强,催化效 率高的优点.其生产过程更节能,产品质量明显提高尤其适用合成化学 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 难以合 成的不饱和脂肪酸的酰胺.由于许多酰胺在有机溶剂中溶解度低,在氨解反应过程中 易于从反直体系析出,这不但能实现产物的在线分离,而且有利于平衡向形成产物的 方向移动.,酯的氨解反应(羧酸可以在脂肪酶作用下形成酯,,然后在同一酶作用下进 行酯氨解反应),不仅是台戚手性酰胺的一个非常有用的方法,也是手性羧酸,手性酯 *广东肯自然科学盘错助项?(No蛐0543) 收稿日期:2003-07一【7,修回日期:~J)00-I2.【0 微生物学通报4 及手性醇动力学拆分的有效途径....周而.具有广泛的应用前景.由于酯氨解反应 是一个新反应,有关的研究甚少,国内迄今未见有关报道本文对乙酸甲基苯甲酯的 立体选择性氨解反应进行了初步的研究,筛选出了具有较高催化活性和对映体选择性 的脂肪酶Novozym435,并进一步探讨了氨源,酶浓度,底物浓度,两底物配比等因素 对该反应的影响 1材料与方法 1.1材料 脂肪酶Novozym435,3811units/rag,来源于Candidaantarctica,固定化于大孔阴 离子交换树脂,丹麦Novo公司赠送;脂肪酶NO.L-3001,210units/rag,来源于小麦胚 芽,购自Sigma公司;脂肪酶Lipoz)~ne,770units/rag,来源于Mucormiehei,由No'~o Norodisk公司赠送;PAPAIN,553units/mg,来源于PapayaLatex,购自Sigma公司;木 瓜蛋白酶,600lalits/mg,购自广州远天酶制剂厂;脂肪酶CCL,2470llnits/rag,来源1= Cand/darugosa,购自Sigma公司;乙酸甲基苯甲酯 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品(外消旋),纯度>99%;十 四烷(内标),纯度>99%,均购自Ald6ch公司.其他化学试剂均为市售分析纯. 1.2方法 1.2.1有机溶剂脱水:将4A分子筛于180?干燥箱内活化2h,置干燥器冷却后,加入 有机溶剂中.室温振荡48h,滤去分子筛,得脱水有机溶剂. 1.2,2反应初始水活度的控制:将冻干的酶与底物,脱水有机溶剂分别置于密闭容器 中,与MgCi2饱和水溶液气相平衡72h,使酶及反应介质的初始水活度为0.33. 1.2.3脂肪酶催化酯氨解反应:在50mL带塞三角瓶中装入预定量的反应底物和脱水有 机溶剂,加酶开始反应,在25?,150r/min振荡,取样0.1rnI_供气相色谱分析用.根 据残留底物乙酸甲基苯甲酯两对映体的浓度及其变化计算反应的对映体选择性和转化 率.其它条件相同的不加酶对照实验表明,在本研究的条件下,未见有非酶反应发生 1.2.4气相色谱分析:仪器:HP4890D气相色谱仪,配备3398化学工作站,氢火焰检 测器;HPCktiral柱(20%Permethyl~tedILeyelodextrin(0.32ram×30m);进样口温度 280?;检测器温度300?;柱温115?保持2min,再以每分钟5?升温速率升至135?, 保持2min;载气为高纯氮,气速2.3mL/min;分流比100:1;进样量为0.4tL在该分 析条件下.乙酸甲基苯甲酯两对映体分离因子n=47用内标法定量.氨解反应方程 式: \ CHNlh120h —————————— Novazym435,I-BuOH 转化率c%=:1.(A+B)/(A0+B0)]×100,对映体过剩值ee%=(B.A)/(B+A)]×100 V=(A0+B0).(A+B)/t;其中ee%为底物对映体过剩值;V表示反应速度 (nmaol/L.h)Ao,B.分别为酶促反应前乙酸甲基苯甲酯两对映体的浓度(mmol/1);A, Hm .二 ? ? 42?微生物学通报2001年船(6) B表示为反应后残存乙酸甲基苯甲酯两对映体的浓度(nm~ol/L);t表示反应时问. 2结果与讨论 2.1酶的筛选 不同来源的酶,其结构及活H中心的差异使其具有不同的特异性.我们利用实验 室现有的4种脂肪酶和2种蛋白酶进行了氨解反应实验,结果如表1所示. 表1不同酶催化乙酸甲基苯甲醋选择性氨解反应比较 厦府条件:IO.OraLMIBK溶液,314nmml/L氡基甲醢咎.314nm~l/L己酸甲基苯甲酯,勘止内标(十四烷) 厦应温度25~1;,振荡频率lS0r/nfin 60 — 50 40 {30 蠢20 10 0 t/h 图1不同酶浓度下酶催化氢解反应过程曲线 表1说明,除了Novoz'~l435有较高的催 化活性和立体选择性,其他酶均表现较低的 催化活性和立体选择性.故选用Novoz'ym435 作进一步的研究. 2.2酶浓度对反应的影响 在研究不同浓度的Novozym435催化乙酸 甲基苯甲酯与氨基甲酸铵的氨解反应中,发 现,酶浓度较低时,随着酶浓度的提高,酶 兰基苯甲酯._,L促氨解反应速度加快,但当酶浓度超过5氨基甲酸铵l正已垸 t=o33),20pL内标(I…"一…….…一….……, 四烷)匣应温度25"C,振荡频率15Of/nil珈L后,继续增大酶浓度,氨解反应速率增 加 - o-ln~/mL-_-_2mg/mL, - &-3rag/mL十5mg/mL甚微.酶浓度对反应立体选择性基本上没有 影响(图1,表2).因此,认为5mg/mL的酶浓度较佳. 表2酶浓度对氨解反应立体选择性的影响 反应条件:同图l 2.3氨源的选择 首先尝试通氨气作为氨源,结果发现不但重现性不好(表3).且反应速度慢,立 2001年28(6)微生物学通报 体选择性差.据文献报道l3l,通氨气的浓度过大可对酶产生毒害作用,可以使用铵盐 作为氨源,于是尝试利用氨基甲酸铵,碳酸氢铵,三乙胺+氯化铵,氯化铵以及氯化 铵+氢氧化钠作为氨源,结果如表4所示. 裹3以氨气为氨源乙酸甲基苯甲醑氨解反应的结果 (十四烷).1OmLMIBK(甲基异丁基甲反应条件:31lnmM/L乙酸甲基苯甲酯,0内标 酮】.,50n~Novom~. 435,氪气流速3mL/min.通气~Imln.反应温度25?,振荡频率为150r/thin 裹4不同氨源对酶催化氨解反应的影响 反应条件:20OL内标(I-IZt~).IOmLM/BK(甲基异丁基甲酮),50ragNovozmy435.加^不同的氪盐.理论 产生氨气314mmol/L,反应温度25?.振荡频率为15Of/rain 由铵盐作为氨源比直接通氨气效果好,不仅容易控制,而且由于氨气逐渐释放, 减少了其对酶的毒害作用.因此反应速度和立体选择性都比直接通氨气高(以氯化铵 为氨源除外).从表中可看出,氨基甲酸铵作为氨源的效果最好,反应2h,转化率达 3426%.反应36h,转化率为54.12%,底物ee%大于99%.而以三乙铵+氯化铵为氨 源时,反应慢,立体选择性稍低,反应2h,转化率为31.17%;而需40h,底物ee%方 达到99%以上.以碳酸氢铵为氨源效果较差,因为它含有一分子的水,水与氨气竞争 为酰基受体反应2h,转化率为28.16%;反 应28h基本达到平衡,转化率为44.45%,残 留底物ee%仅为76.1%.氯化铵+氢氧化钠 为氨源结果与碳酸氢铵相仿,而氯化铵为氨 源时效果最差,反应2h转化率仅为3.42%; 反应43h,转化率仅为20.6%,底物ee%为 14.2%因此我们认为以氨基甲酸铵为氨源较 啦 e 警 宜.图2氨基甲酸铵浓匪x寸酶催化氮解反应的影响 2.4氨基甲酸铵浓度对氨解反应的影响反应剁十31/L己酸摹酯?10: 为了选择一个最适合的氨基甲酸铵浓度,Qu 分别比较了氨基甲酸铵浓度为:15.75retool/+165n~]/I-II-315nm~l/L,?一495tr~l/L L31.4mmol/L,47.1mmol/L,62.8mmol/L一d/L'825/L 和78.5mmol/L的反应,结果如图2,表5所示 微生物学通报2001年28.(6) 表5氨基甲酸铵浓度对酶催化乙酸甲基苯甲酯氨解反应的影响 &最什:H2 在所研究的氨基甲酸铵浓度范围内,随着其浓度的增大,氨解反应速度加快反 应2h,反应的转化率依次为2436,27.O3,2968,33.皿,3426%.但酶反应的对映 体选择性在氨基甲酸铵浓度157rnmol/L,47.1mn~l/L范围内,随着其浓度的增加而增 大而当其浓度超过47.1n~nol/L时,立体选择性略有下降.可能是因为随着氨基甲酸 铵浓度的改变,酶的微环境略有变化,从而影响了酶分子的构象,进而影响酶分子与 两对映体的"契合".当氨基甲酸铵较低时,酶的立体选择性也有降低,这可能是因为 反应体系中与氨解反应相竞争的立体选择性较差的副反应一酯水解反应的比例加大 因此从反应速度和酶的立体选择性及经济性考虑,我们认为氨浓度以31.4n~nol/L为 宜. 酶浓度,底物浓度等因素对Novozym435催化乙酸甲基苯甲酯氨解反应均有显着 影 响以10mL正己烷(aw=0.33)为反应介质,酶浓度为5mg/mL,Novozym435催化 31.4mmol/L乙酸甲摹苯甲酯和31.4nmaol/L氨解甲酸铵进行氨解反应,反应6h,转化 率为5216%,残留底物(一)一乙酸甲基苯甲酯对映体过剩值可达99%以上. 参考文献 [1RaffaeleM,CAovam6N,AngelaPTelrahedrorl:Asymmetry.1995,6(7):l77],l778 【2?CS,Yoshi?nF.GargGJAmOaemSoc.1982,?(3):7294,7299 [3jMLkeJJ.L~ensCM.AdrieJJ,etal1缸曲ed咖,1999.55t2j:l24?,ll8 l4JeMC,RantwijkF,SheIdonRACakaly~sToday.1994,22(?:563,590 5Jz0eMC.DenACJMelCataJB,l蛳,2:l4l,l45 6JMC,DalenAC,SheldoaRAJMo1.CatalB,l嘲,2:l9,25 7lWe~nanMA,HackingMAP,SheldonRATewakedron:As'ynm~y1999,l0:1739,l l8JEdllaldoGU,FranciscaR,VicenteGTetrahodron:A,symmetry.I999,10:72I,726 l9JZoeteMC.OaldellAC.SheldonRABiocalal3,sis,1994,加:3O7,3l6 I10JStammnsWAJ.OoppenRG,ZwanenburgBk【?:Asymmetry,1998,9:429一 ' ;中国科学院为进. ?底开展了优秀期刊评比 ;秀期刊t等奖 ''').'.,.n?t 好消息 步提高期刊的办刊质量使期刊得到不断的发展,在2000年》 活动,共评审出93种获奖期刊,其中《微生物学通报》荣获优; :.:...'.研.ctc:(.(c,<乜.:c.c.(c'c心(t(.(c'.