用Trizol提取DNA,RNA及蛋白质的方法及注意事项

用Trizol提取DNA,RNA及蛋白质的方法及注意事项 TRIZOL试剂 警告:接触皮肤或误吞将导致中毒或灼伤。接触皮肤之后立即用去垢剂和水冲洗。若感到不适，请遵医嘱(可能的话出示标签)。 收到药品后，在室温下存储。以已证明TRIZOL在常温下可稳定储存12个月。 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 : TRIZOL是一种从细胞和组织中提取总RNA的现用试剂。该试剂是一种苯酚异硫氰酸酯单相溶液，它发展自Chomczynski 和 Sacchi的RNA一步抽提法。在细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相。RNA只留在水相中。转移水相后，用异丙醇沉淀回收RNA。除去水相后，样品中的DNA和蛋白质也可以用后续沉淀方法回收。用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质。DNA的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有用。 这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各种量的组织(低至50-100mg， 67高至?1g)和细胞(低至5×10，高至,10)都有良好的效果。其简单的操作方法允许同时处理大量样品。整个过程可在1小时内完成。用TRIZOL提出的总RNA +不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern 电泳分析、斑点杂交、poly (A)选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。在PCR和扩大DNA酶?梯度分离中，建议使用一个内含子中的两个引物。 TRIZOL简化了各种类型的大分子及小分子RNA的分离。例如，从鼠肝分离的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNA条带,(由mRNA和hnRNA组成的)两个约5kb(28S)和2kb(18S)核糖体RNA的条带，以及介于0.1到0.3kb(tRNA, 5S)的小分子RNA的条带。所分离的RNA稀释于TE时A/A之比大于等于1.8。 260280 谨防RNase的污染: 在提取中任何不正确的操作方法中都可能偶然引入RNase。由于其活性难以抑制，因此只能直接避免其引入。在处理RNA时需要注意以下规则。 戴一次性手套。皮肤上往往沾有污染RNA的细菌或霉菌，并成为RNase的来源。训练良好的微生物学操作方法以避免微生物污染。 使用无菌的一次性塑料实验用品和移液枪进行RNA操作，避免公共用具的Rnase交叉污染。例如，用RNA探针的实验室一般会用到RNaseA或T1以降低滤器背景，而任何不能丢弃的实验用品(如移液枪)可能沾有大量的RNaseA。 TRIZOL可以有效防止RnaseA污染。下游样品的处理需要无RnaseA得玻璃或塑料器皿。玻璃器皿应该在150?下烘烤4小时，塑料制品应用0.5M的NaOH浸泡10分钟，再用水充分冲洗，最后高压灭菌。 其他注意事项: 在装2ml体积的TRIZOL时，建议用透明的一次性聚丙烯管。 用于更大体积时，用玻璃管或聚丙烯管，并试验其能否经受1200gTRIZOL的离心力以及氯仿的腐蚀。不要使用泄露或有裂缝的管子。 离心前小心地称重平衡。 离心前玻璃管需用石蜡膜封闭管口，聚丙烯管必需加盖。 RNA分离技术指南 警告:使用TRIZOL时一定要戴手套和护目镜。避免接触皮肤或衣服。在化 学通风橱操作，避免吸入其蒸气。 除特殊情况外，试验操作及试剂存储温度都要求在15-30?。 需要但无需补充的试剂: 氯仿 异丙醇 75%乙醇(用于焦碳酸二乙酯处理水) 不含RNase水或0.5%SDS溶液(不含RNase水的配制:将水加入不含Rnase 玻璃瓶，添加焦碳酸二乙酯至0.01%(v/v)，静置过夜，高压灭菌;SDS溶液的配 制要用焦碳酸二乙酯处理的无菌水。) 1(匀浆化 a. 组织 每50-100mg组织加入1mlTRIZOL在玻璃管中用电力匀浆机匀浆化。 取样容积不能超过用于匀浆化的TRIZOL的体积的10%。 b. 单层培养细胞 将1mlTRIZOL加入3.5cm培养皿，用移液枪吹打几次，直接将细胞消 2化。TRIZOL的加入量取决于培养皿的体积(每10cm加1ml)，而非 细胞数。如果加入不足会造成提取RNA被DNA污染。 c. 悬浮培养细胞 6离心沉淀细胞。在TRIZOL中反复吹打使细胞消化。每5-10×10个动 物、植物或酵母细胞或每5-10×106个细菌细胞加1ml消化剂。在加入 TRIZOL之前先不要洗细胞，因为这会促进RNA的降解。如果需要破 碎酵母或细菌细胞就要用到匀浆器。 任选:当处理样品是一些含有大量蛋白、脂肪、多糖和胞外物质的材料如肌肉、脂肪组织、植物的块茎部分等时，还需要添加额外的分离步骤。均一化结束后，在2-8?下以12000g离心10分钟从匀浆中除去不容部分。该部分含有细胞膜、多糖和大分子DNA，而RNA含在上清液中。脂肪组织样品需要将上层过剩的脂肪收集除去。每次都将清除过得匀浆液转移到新管中，加入氯仿，按前述步骤分离固液相。 2(相分离 将经过匀浆化处理的样品在15-30?下孵育5分钟，使核蛋白复合体 完全分离。每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿，小心加盖。用手剧烈震管子15 秒，然后在15-30?孵育2-3分钟。在2-8?下以最高12000g离心力离心 15分钟，混合物分为成下层红色苯酚-氯仿相、相界面和上层无色水相。 RNA只存在于水相。水相体积约占均一化TRIZOL试剂体积的60%。 3(RNA沉淀 将水相转到新管，如果需要分离DNA或蛋白质的话保存有机相。向 水相加入异丙醇沉淀RNA，每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇。在15-30? 下孵化样品10分钟，在2-8?下以最高12000g离心力离心10分钟。通常 不可见的RNA在离心后在管底形成胶状沉淀。 4(RNA洗涤 弃去上清。用75%乙醇洗涤RNA一次，每1ml每1mlTRIZOL加 1ml75%乙醇。涡旋混合样品，并在在2-8?下以最高7500g离心力离心5 分钟。 5(再溶解RNA 结束时简单干燥RNA沉淀(空气干燥或真空干燥5-10分钟)。不要 用真空离心的方法干燥RNA。防止RNA完全干燥非常重要，因为那样会 比 < 1.6。加明显降低RNA的溶解性。部分溶解RNA样品使其A260/280 入无RNase水或0.5%的SDS溶液，用移液枪吹打几次，在55-60?下孵 育10分钟，溶解沉淀。(如果RNA要用于酶促反应，就要避免加入SDS。) RNA也可以溶于100%的甲酰胺(去离子)，-70?保存。 RNA分离注意事项: 241(从少量组织(1-10mg)或细胞(10-10)样品中分离RNA:向组织或细胞 中加入800μlTRIZOL，用相同的方法加入氯仿按照相分离第二步操作。用 异丙醇沉淀RNA之前，先加入5-10μg淀粉作为转入水相的载体。为降低 粘度，在加入氯仿之前现用26计量注射针剪切基因组DNA。淀粉留在水 相与RNA一起沉淀出来。当浓缩至4mg/ml时淀粉不会抑制单链合成和 PCR。 2(匀浆化之后加入氯仿之前，样品可以存于-60到-70?至少一月。RNA沉 淀(第四步，RNA洗涤)可以保存在75%乙醇2到8?下至少一周或-5 到-20?下至少一年。 3(如果第二、三步的离心时间可以达到30-60分钟，最高可达2600的台式 离心机也适用于本实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。 DNA分离技术指南 如RNA分离实验所述，完全除去水相之后，存在于相界面和酚相的DNA就 可以从原来的匀浆中分离出来。经过沉淀和一系列的洗涤之后，将DNA溶于8mM 的NaOH溶液。TRIZOL可以回收组织或培养细胞的全DNA，因而它可用于测定 待分析样品的DNA含量。同时抽提基因组DNA，使每个基因组对应的Northern 分析结果归一化成为可能，避免了总RNA或组织重量变化的影响。(基于不同来 源，有的DNA沉淀在使用之前可能还需要进一步的纯化(如酚抽提)。 需要但无需补充的试剂: 乙醇 0.1M柠檬酸钠溶于10%乙醇 75%乙醇 8mM的NaOH 1(DNA沉淀 除去留在相界面以上的水相，用乙醇沉淀相界面和有机相中的DNA。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加0.3ml无水乙醇，倒置混匀。然后在15-30?下存储2-3分钟，在2-8?下以最高2000g离心5分钟沉淀DNA。 小心除去水相对分离DNA的品质非常重要。 2(DNA洗涤 除去上层的酚-乙醇，如果需要的话保留以备蛋白分离。在含0.1M柠檬酸钠的10%乙醇中洗涤DNA两次，每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加 1ml洗涤溶液。每次洗涤，都将DNA沉淀在洗液中15-30?下保存30分钟(周 期性混合)，并在2-8?下以最高2000g离心5分钟。两次离心之后，将DNA 沉淀在75%乙醇(每1ml TRIZOL，加1.5-2ml75%乙醇)15-30?下保存10-20 分钟(周期性混合)，并在2-8?下以2000g离心5分钟。 DNA含量高于200μg的沉淀或大量不含DNA的样品都需要在0.1M钠 的10%乙醇溶液中再洗涤一次。 3(再溶解DNA 在开放的管中空气干燥DNA5-15分钟。(不要用离心干燥，因为那将造 7成溶解困难。)用8mM的NaOH溶解DNA至终浓度为0.2-0.3μg/μl。从10 细胞或50-70mg组织中分离的DNA需要加300-600μl8mM的NaOH。建议将 DNA重悬于弱碱，因为分离的DNA不易重悬于水或Tris缓冲液。8mM的 NaOH溶液pH约为9，DNA溶解后应该很容易用TE或HEPES调节。在该 阶段，DNA样品(尤其是源于组织的)可能会含有不溶性胶状物质(细胞膜 碎片等)。用12000g离心10分钟除去不溶物，将含DNA的上清移至新管。 溶于8mM的NaOH的DNA可以在4?保存过夜;如果需要延长储存时间， 就需要用HEPES调节pH至7-8(见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf )，并补充1mM的EDTA。调好pH后， DNA可保存于4?或-20?。 DNA的定量和期待产率 取一部分溶于8mM的NaOH的DNA样品溶液，与水混合，测定所得溶液的A。用双链DNA的A值计算其含量，一个A单位相当于50μg双链DNA/ml。260260260 要计算分析样品的细胞数时，可以假定每个人、大鼠、小鼠的二倍体细胞的DNA含量分别为:7.1μg、6.5μg、5.8μg。 应用: 用PCR扩增DNA:用8mM的NaOH再溶解DNA后，用0.1mM的HEPES调节pH至8.4(见表)。加0.1-1.0μg样品到PCR反应混合液，执行标准的PCR反应。 限制性内切反应:用HEPES调节DNA溶液pH至预定值(见表)，也可以选择用1mM，pH7-8的EDTA透析样品。每微克DNA用3-5单位酶。个别酶条件依照厂家建议，让反应进行3-24小时。在典型的测试试验中，80-90%的DNA是可消化的。 DNA样品溶解的8mM NaOH的pH调节: (1ml8mM的NaOH需用0.1M或1MHEPES的量) 0.1 M HEPES (μl) 1 M HEPES (μl) Final pH Final pH 8.4 86 7.2 23 8.2 93 7.0 32 8.0 101 7.8 117 7.5 159 DNA分离注意事项: 1(酚相和相界面可在2-8?保存过夜。 2(悬于75%乙醇的样品可在2-8?保存数月。 3(溶于8mM的NaOH的样品可在2-8?保存过夜。需要更长保存时间的话， 要将pH调至7-8，并将EDTA浓度增至1mM。 蛋白质分离技术指南 蛋白质分离自用乙醇沉淀DNA之后的酚-乙醇相(DNA再沉淀第一步)。所 的样品可以用于WB分析特异性蛋白。 需要但无需补充的试剂: 异丙醇 0.3M盐酸胍溶于95%乙醇 75%乙醇 1%SDS 1(蛋白质沉淀 用异丙醇从酚-乙醇上清液(每1mlTRIZOL约加0.8ml)沉淀蛋白质。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加1.5ml异丙醇。在15-30?下存储样品10分钟，2-8?下以12000g离心10分钟沉淀蛋白质。 2(蛋白质洗涤 除去上清，在含0.3M盐酸胍的95%乙醇中洗涤蛋白质沉淀3次。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加2ml洗液。每一轮洗涤时，将蛋白质存于15-30?的洗液20分钟，并在2-8?下以75000g离心5分钟。最后一次洗涤完成后。用2ml乙醇涡旋蛋白质沉淀。在15-30?下保存乙醇中的蛋白质沉淀20分钟，并在2-8?下以75000g离心5分钟。 3(再溶解蛋白质 真空干燥蛋白沉淀5-10分钟。用移液枪将其溶于1%的SDS。彻底溶解蛋白质沉淀需要在50?孵育。在2-8?下以10000g离心10分钟沉淀所有不容物，将上清移至新管。所得样品可以用于WB或在-5到-20?储存备用。 蛋白质分离注意事项: 1(悬于乙醇或含0.3M盐酸胍的95%乙醇的蛋白质沉淀可以在2-8?下储存 至少1月，在-5到-20?下储存至少1年。 2(以下备选方案可以获得更高的回收效率。在2-8?下用0.1%SDS透析酚- 乙醇上清3次，再以10000g离心10分钟。澄清的上清液可用于WB。 3(只要SDS浓度低到不会产生影响(,0.1%)，就可以用Bradford定量蛋白。 也可以用没有去垢剂影响，不依赖于A/ A的方法(微量的酚会造成260260 蛋白质浓度结果偏高)。 常见问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 解决: RNA分离 61(每mg组织或1×10培养细胞的RNA期望产率 肝、脾，6-10μg 肾，3-4μg 骨骼肌、脑，1-1.5μg 胎盘，1-4μg 6上皮细胞(1×10培养细胞)，8-15μg 成纤维细胞，5-7μg 2(低产率 样品匀浆化或消化不完全 RNA沉淀再溶解不完全 /A <1.65 3(A260280 分光光度分析前将RNA溶于水而，没有溶于TE 低离子强度和低pH溶液使280nm吸光值升高 样品匀浆化试剂的体积太小 样品匀浆化处理之后，没有在室温下存放5分钟 水相被酚相污染 最终RNA溶解不足 4(RNA降解 组织从动物体分离后没有立即处理或冷冻 用于分离的样品或分离得的RNA样品保存在-5到-20?，而不是-70到-70? 细胞被胰蛋白酶消化了 水溶液或管子含有RNase 在pH以下3.5，将甲醛用于琼脂糖凝胶电泳 5(DNA污染 样品匀浆化试剂的体积太小 用于分离的样品中含有有机溶剂(如乙醇、二甲亚砜)、强缓冲溶液或碱性溶液 6(糖蛋白或多糖污染 以下经过优化的RNA沉淀技术可以从分离RNA中除去这些化合物。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL加0.25ml高盐沉淀液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaOH)，然后向水相加入0.25ml异丙醇。混合、离心，并按前述方案继续。该优化方案可以有效地沉淀RNA，而且可以使多糖和糖蛋白保持可溶状态。从含有大量多糖的植物组织中分离高纯度RNA时，就需要对开始的匀浆液进行改良的离心。 DNA分离 61(每mg组织或1×10培养细胞的DNA期望产率 肝、肾，3-4μg 骨骼肌、脑、胎盘，2-3μg 6人、大鼠及小鼠培养细胞(1×10)，5-7μg 成纤维细胞，5-7μg 2(低产率 样品匀浆化或消化不完全 DNA沉淀再溶解不完全 3(A/A <1.7 260280 分光光度分析前将DNA溶于水而，没有溶于TE 苯酚没有从DNA样品中被充分除去。用溶于10%乙醇的0.1M柠檬酸钠再洗涤DNA沉淀1次。 4(DNA降解 组织从动物体分离后没有立即处理或冷冻 用于分离的样品或分离得的RNA样品保存在-5到-20?，而不是-70到-70? 样品在Polytron或其他高速匀浆器中被匀浆化 5(RNA污染 未完全除去水相 DNA沉淀未用溶于10%乙醇的0.1M柠檬酸钠有效洗涤。 6(其他应用 用于PCR扩增之前先将pH调至8.4 用限制性内切酶处理DNA时，先将pH调至预定值，每微克DNA用 3-5单位酶，个别酶条件依照其最优条件让反应进行3-24小时。一般80-90% 的DNA都是有效的。 蛋白质分离 1(低产率 样品匀浆化或消化不完全 蛋白质沉淀再溶解不完全 3(蛋白质降解 组织从动物体分离后没有立即处理或冷冻 4(聚丙烯酰胺凝胶电泳中条带畸形 蛋白质沉淀没有充分洗涤 如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。