华南师范大学实验
报告
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学生姓名何茂辉学号20062501302
专业生物科学
年级
六年级体育公开课教案九年级家长会课件PPT下载六年级家长会PPT课件一年级上册汉语拼音练习题六年级上册道德与法治课件
、班级06科三
课程名称细胞生物学实验实验项目
实验类型□验证□
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
□综合实验时间09 年 5 月19 日
实验指导老师尤蓉、周仁超实验评分
细胞融合和凝集素对细胞的凝集反应
实验目的:
1.通过实验了解细胞融合的
方法
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与原理;掌握用PEG诱导细胞融合的方法。
2.通过实验了解细胞膜的表面结构;掌握凝集素促使细胞凝集的原理。
实验原理:
1.细胞融合是指两个或两个以上的体细胞合并成为一个具有双核或多核细胞的过程;也称细胞杂交,在自然情况下的受精过程即属这种现象。细胞融合可采用人工条件 (生物的、物理的、化学的)下进行。
2.聚乙二醇分子( PEG )介导的细胞融合应用最为广泛,因为它易得,简便,且融合效果稳定。PEG的结构为:HOH2C(CH20CH2) n CH2OH,相对分子质量在400-6000的PEG均可用作细胞融合剂。
3.细胞质膜是由蛋白质不同程度镶嵌在脂双层中所形成的动态流动结构,蛋白质和脂类分子又与寡糖链结合为糖蛋白和糖脂分子,糖蛋白和糖脂分子伸至细胞表面的分枝状寡糖链在质膜表面形成细胞外被。
4. 凝集素凝集素是一类可逆结合特异糖基的蛋白质,能与细胞外被的寡糖链相连接,使细胞发生凝集。
实验步骤:
细胞融合(鸡血红细胞)
1.血液洗涤
取抗凝鸡血1mL,移入10mL离心管,加入4mL0.85%生理盐水混匀,1500rpm离心5 min。再洗涤离心1次,最后弃去上清,加GKN液4ml,再洗涤离心1次。
2.红细胞悬液制备
收集最后1次离心沉淀的血细胞,加入适量的GKN溶液,按压积红细胞体积配成10%的红细胞悬液,镜检细胞密度。
3.细胞融合的诱导
(1)取以上细胞悬液0.5ml放入10ml的EP管中,然后放入37℃水浴中预热,同时将50%PEG液一并预热20min。
(2)取1ml的50%PEG溶液逐滴沿离心管壁加入到0.5ml细胞悬液中,边加边摇匀,置37℃水浴中保温20min。
(3)沿管壁加入GKN溶液5ml以终止PEG反应,静止于水浴中10~20min左右;
(4)1500r/min离心5min,弃去上清,加GKN溶液洗涤离心1次。
(5)弃去上清,加入GKN液少许,混匀,取少量悬浮于载玻片上,加入0.2%詹纳斯绿染液,混匀, 3min后盖上盖玻片,观察细胞融合情况。
细胞凝集反应(兔血红细胞)
1.2%兔血红细胞制备
抗凝剂兔血1ml,用生理盐水洗3~5次,每次2000rpm离心5min;最后按压积红细胞体积加生理盐水配成2%兔血细胞液
2.马铃薯凝集素提取
称取马铃薯去皮块茎2g,加少许磷酸缓冲液研磨成匀浆,最终加到10ml磷酸缓冲液,浸泡片刻,浸出的粗提液中含有可溶性马铃薯凝集素。
3.兔血细胞凝集反应观察
吸取马铃薯凝集素粗提上清液1滴置载玻片上, 加入2%兔血细胞液1滴, 充分混匀,加盖玻片,静置片刻,置光学显微镜下观察细胞凝集现象。
用一滴磷酸缓冲液和一滴2%兔血细胞液混合作为对照观察。
结果与分析:
1.根据观察统计所得,细胞平均融合率=65/438×100﹪=14.84﹪。影响细胞融
合的因素有PEG的分子质量、浓度、作用时间、反应温度、细胞的生理状态与密度等。
2.细胞质膜是由蛋白质不同程度镶嵌在脂双层中所形成的动态流动结构,蛋白
质和脂类分子又与寡糖链结合为糖蛋白和糖脂分子,糖蛋白和糖脂分子伸至细胞表面的分枝状寡糖链在质膜表面形成细胞外被。凝集素是一类可逆结合特异糖基的蛋白质,能与细胞外被的寡糖链相连接,使细胞发生凝集。
思考题:
1.如何测定凝集素的活性与效价?
凝集素的活性分为凝集活性和免疫活性两个方面 ,因而其测定方法也按凝集活性测定和免疫活性测定两个方面进行分类。凝集活性测定方法包括红细胞凝集试验和功能性凝集素测定 ,免疫学测定方法包括火箭免疫电泳、酶联免疫吸附试验、免疫印迹法等测定方法。
2.凝集素活性的影响因素有哪些?
凝集素活性的影响因素有温度、pH、变性剂等理化因素。
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