微波对阿维拉霉素产生菌诱变效应的研究

微波对阿维拉霉素产生菌诱变效应的研究 微波对阿维拉霉素产生菌诱变效应的研究 ? 32?现代生物医2oo6Vo1.6No.4 微波对阿维拉霉素产生菌诱变效应的研究 朱传合贺亚男路福平杜连祥 (天津科技大学生物工程学院,天津市3~,Ak微生物重点实验室天津300222) 摘要:阿维拉霉素产生茵SV微波诱变效应的研究发现:菌株SV对微波敏感(微波 茵落 处理60s,SV菌株存活率低于10%), 形态变化大.微波诱变处理最佳作用方式为培养皿不加盖,快速冰上冷却,最佳处 理时间为5Os(其正突变率25.3%o通过微波 诱变处理,阿维拉霉素推理筛选,最终获得一株稳定性良好,阿维拉霉素产量达到 21.5mg/L,较出发菌株提高119.4%的突变株 SV一15. 关键词:微波;阿维拉霉素;诱变效应 AStudyonMutageniceffectsofAvilamycin—— producingStrainInducedbyMicrowaveIrradiation ZHUChin—he.HEIra一?n,LUFu—ping,DUlJan—xiang TianfinKeyLabofIn&tstrlalMicrobiology.Col~geofBiotechnology.Tianjinlhuversi tyof&拓?dTedmology,Tianfin,300222China ABSTRACT:ToinvestigateMutagerficeffectsofAvilamyein— tmxtucingStraininducedbynficrowaveirradiation.Theexperimentalre— sultsindicatedthatthecapacityofSVstraintOmicrowaveirmdiationwas~nsitive(itsstrrviva lratewasunderl0%for60sradiation).Notsealing theculturedishandfastcoolingitwas山 eoptimalirradiafionmodeofmicrowave,and50secondswastheoptimalirradiationtimeofm icrowave' (positivemutationrate,25.3%).Toobtainhigh—yieldavilamyein— producingstrain,50smicrowaveirradiationandscreeningofavilamycin— rationalmutantisusedforthestudyonscreeningmutation.SV一15illutalltSwereobtained,andthemutantco~fldproduce21.5m#Lavilamycin, wlfiehwas2.194timesasmuchasthepotencyoforiginalstrainbyf1akefermentation. Keywords:Microwave;Avilamiein;Mutagenieeffects 微波辐射属于一种低能电磁辐射,能刺激水,蛋白质,核 苷酸,脂肪,碳水化合物等极性分子快速震动….生物效应的 频率范围在300MHz,300GI-lz,现在--一般多采用2450MHz在 2450MHz频率作用下,水分子能在18内180.来回转动24.5亿 多次,强烈的震动和摩擦使得细胞内DNA分子氢键和碱基堆 集化学力受损,最终引起DNA分子结构变化导致菌株发生遗 传变异;而且微波所具有的传导作用和极强的穿透效应使细 胞壁内外的水分子产生剧烈震动和摩擦,改变了其通透性,更 易使细胞内代谢物分泌出来.这些生理生化方面的变化会使 得生物体产生一系列的突变效应….因此,微波被广泛用于 多个领域的诱变育种,如农作物育种,禽兽育种和工业微生物 育种I2,. 阿维拉霉素是由绿色产绿链霉菌(StreptomyeeViridoetu'o. mogenes)经过发酵而得.它属于正糖霉素族的寡糖类抗生 索,是一种特殊的蛋白质合成抑制剂'4』,通过与细菌核糖体结 合来抑制蛋白质的合成,从而达到抑菌的目的.它主要抑制 革兰氏阳性菌,而对革兰氏阴性茵效果较差【.6J.阿维拉霉素 作为代谢终产物对其产生菌的调节作用可能有两个方面:一 是作为终产物对参与其合成的有关酶进行反馈调节:二是对 产生菌本身具有抑制,杀死作用.因此,随着自身代谢终产物 耐受性的提高,产生菌合成阿维拉霉素的能力也将得到提 高_7J.本研究采用微波对菌株sv进行诱变,辅以阿维拉霉素 (自身代谢产物)推理筛选获得了一株稳定性良好的高产sV一 15突变株. 作者简介:朱传台,男,1978.LU东郓城人.博士研究生 现从事工业微生物育种和微生物制药方面的研究工作. 科学基金资助项目:横向合作.Entail:chilanhe~u@yahoo.conl,cno 通讯作者:杜连祥,电子信箱;dlx@rust.edu.cn.电话:022—60270037 (收稿日期:2006—04—03接受日期:2006—04—23) 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株出发菌株:绿色产绿链霉菌(StreptomycesViri— doebromogen)SV,本研究室保存;敏感菌株:藤黄微球菌(Microc OIlSluteus)10209,中国工业微生物菌种保藏中心(保藏号为:cI CC10209). 1.1.2培养基斜面培养基:高氏一号合成琼脂培养基【; 平板分离培养基:高氏一号合成琼脂培养基_8; 种子培养基(L):麦芽汁1O,酵母浸粉4,葡萄糖4,Cack 0.1.pH7.2: 发酵培养基(L):葡萄糖2(),酵母浸粉16,缬氨酸2.3, CaCh0.11pit7.2: 敏感菌活化培养基:营养琼脂; 生物 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 培养基(L),上层:酵母膏3,蛋白胨10,牛肉膏 5,葡萄糖10,氯化钠5,琼脂10,pH7.2;下层:素琼脂20. 以上培养基灭菌条件:121?,15—20min. 1.2方法 1.2.1分析方法阿维拉霉素含量采用HPLC法J. 1.2.2单孢予悬液制备将新鲜斜面孢子用适量生理盐水 洗下,转移到有玻璃珠的无菌三角瓶中振荡打散,用无菌脱脂 棉过滤,调整孢子浓度为108个/mL. 1.2.3微波诱变处理取制备好的单孢子悬液5mI于培养 皿内,放入家用微波炉(微波源为2450MHz,850W)中,中等强 度辐射.辐射分四种方式:培养皿加盖不冷却;加盖冷却;不 加盖冷却;不加盖不冷却.加盖不冷却及不加盖不冷却,辐射 时间分别为10,20,30,4o,50,6o,80,100,120s,各取0.1mL适当 稀释涂布.加盖冷却及不加盖冷却,辐射10s,冰上快速冷却 10s再辐射,辐射时间累计分别为10,20,30,4o,50,60,80,100, 120s.各取0.1mL适当稀释涂布.37~C培养4d. 代生物医学进展ProgressinModernBiomedicine2006vo16N0.4?33? 12.4出发菌株阿维拉霉素最小抑制浓度测定将制备好 的孢子悬液分别涂桕于含有不同浓度阿维拉霉素的培养基平 板上,37.C培养35d,记录平板上未长菌落的阿维拉霉索最 低抑制浓度(M.IC),即确定为阿维拉霉素对该菌的最小抑制浓 度(MIC). 1.2.5初筛琼脂柱法:用(p{j打孔器打出若干单菌落,对其 进行敏感菌检测,利用抗生素效价测量仪测量抑菌圈直径. 以琼脂柱抑菌圈直径大小作为初筛 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 . I.26复筛摇瓶发酵复筛:选取抑菌圈直径较大的菌落进 行摇瓶发酵,发酵结果采用?lI法测定阿维拉霉素产量. I.2.7发酵方法 I.2.7.I摇瓶种予培养用适量无菌水洗下斜面孢子,充分 振荡,制备成孢子悬浮液,计数并调整孢子悬浮液的孢子浓度 为108个/mL.吸取适量孢子悬浮液于装有3OraL种子培养基 的250n~L三角瓶中,28,180r/min振荡培养至对数生长期. 1.2.7.2摇瓶发酵将摇瓶种子培养液以2%的接种量转接 到装液越为5OraL的25OraL三角瓶中,28?,180r/min回转式摇 床发酵72h 2结果与分析 2.1微波诱变对sv菌株存活率的影响 取制备好的单孢子悬液5mL于培养皿内,放人家用微波 炉中,根据试验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 进行中等强度辐射.计算其存活率,绘制 存活率曲线如图1 110 100 黉898 童58 蓬鲻20 lO 0 0204o6080100120 辐射时间(h) Irradiationtilife 图I微波诱变对sV菌株存活率的影响 Fig.1lhesurvivalrote0fSVstrainbymicrowave 从网1可以看出,加盖不冷却及不加盖不冷却的微波辐 射,在微波辐射20s后,菌株全部死亡,其主要原因是由于微 波辐射的热效应使孢子悬液的温度快速升高,高温使孢子迅 速死亡.两种辐射方式对菌株存活率影响基本.I-没有差别, 其主要原因不加盖的散热速率远远低于其温度升高速率.加 盖玲却及不加盖冷却两种辐射方式的菌株存活率曲线基本一 致,其菌株存活率均随着辐射时问的延长而降低,微波辐射时 间为120s时,其存活率均趋近于零.菌株存活率逐渐降低的 原是微波效应有热效应和非热效应,非热效应也有致死作 用,虽然我们通过冰上快速降温尽可能减少其热效应,但是也 可能完全消除热效应的影响,微波辐射的非热效应及极少 部分热效应的累积使菌株逐渐死亡,造成其存活率逐渐下降. lOs短时问不加盖散热远远低于冰上热交换降低热效应作用 是造成两种辐射方式菌株存活率曲线基本一致的原因. 2.2微波诱变对sV菌株突变率及正突变率的影响 根据2.1可知,在菌株微波诱变中主要是利用其非热 效应.虽然不加盖散热作用与冰上冷却相比微不足道,但是, 为了尽可能降低其热效应,我们选择微波辐射方式为不加盖, 冷却.采用琼脂柱法检测每个辐射时间下的菌落抑菌圈变化 情况,规定抑菌圈直径高于对照株(sv)1%的突变株称为正突 变,小于1%的为负突变,?1%之间的为未突变.试验结果图 2 图2微波诱变对SV菌株突变率及正突变率的影响 Fig.2Mutaionrate&tw,sitivemutationrateSVstn~nbythemincrowave 图2可知,随着微波辐射时间的增加,菌株突变率随之增 加;在辐射时间低于50s时,其正突变率随着辐射时间的增加 而增加,辐射时间在50s时,菌株的正突变率到达最高(25. 3%),此时菌株存活率为2O7%(图1).辐射时间超过50s以 后,菌株的突变率继续增加,但其正突变率呈现降低的趋势. 分析原因,可能是由于短时间辐射对菌株造成生理生化效应 不足以引起菌株大量的突变,且容易发生回复突变,而长时间 的辐射,由于微波的非热效应和极少部分的热效应的累积引 起较剧烈的生理生化效应使DNA及生物膜等生物大分子的损 伤严重,从而导致较高的突变率和低的正变率.微波辐射时 间为50s左右时,非热效应和极少部分的热效应的累积引起的 生理生化效应比较温和,DNA的损伤不很严重,所以菌株的 正突变率较高的. 2.3微波辐射对sV菌株菌落形态的影响 微波诱变阿维拉霉素产生菌形态变异高于自然分离情 况,出现多种变异形态.?单菌落边缘不整齐,绿色孢子,表 面孢子稀少;?单菌落全部为绿色孢子,无白边,菌落扁平,表 面孢子稀少;?圆形凸起,单菌落全部为绿色孢子,无白边,表 面孢子稀少;?草帽型,凸起部分为绿色,边缘白色,表面孢子 稀少;?草帽型,全部为绿色孢子,表面孢子稀少;?菌落扁 平,表面出现油滴状,灰色;?同心圆,全部为白色孢子,表面 孢子丰富;?同心圆,中间为绿色孢子,边缘为白色孢子,表面 孢子稀少;?同心圆,全部为绿色孢子,表面孢子稀少;?圆形 菌丝凸起,没有孢子. 2.4高产菌株的筛选 2.4.1阿维拉霉素对SV菌株孢子致死浓度测定分别取浓 度为108个/mL的孢子悬浮液0.1涂布于含有不同浓度的阿 维拉霉索培养皿中,结果见表1.由表1可知,阿维拉霉素对 sv菌株孢子最小致死浓度(?C)为150t~mL. =a詈^管?竽鲁*0 一l虫 ?坫m50 ?伯?????0 E|1I ^一僻 ? 34?现代生物医学进展ProlwessinModernBiomedicine2006Vo1.6No.4 表1阿维拉t素对sV菌株孢子致死浓度测定 Teble1theSVstrainMICofavilamyein 注:+为有菌落生长.一为无菌落生长Note:+Growth,一Notgrowth 2.4.2高产菌株的筛选在最佳辐射时间下(50s)下进行微一不含阿维拉霉素的高氏培养基中,待菌落长成后,进行琼脂 波诱变处理,适当稀释涂布于含阿维拉霉素高氏培养基平板柱初筛.选取抑菌圈直径大9.0ram的20株高产菌进行复筛, 上,挑选菌落形态不同菌株的1800株阿维拉霉素菌落转入另取三次试验的平均值,结果如表2. 表2高产突变株复筛结果 Teble2theresultsofmutationsecondscreening 2.4.3高产菌株的稳定性试验 根据2.4.2试验结果,我们选择阿维拉霉素产量在20. 0mg/L以上的5菌株,用群体传代的方法考察其的斜面稳定 性,进行反复传代5代.取三次试验的平均值,结果如表3. 裹3菌株sV稳定性实验结果 Table3theexperimentalresults0fSVstrainstability 由表3可知,在上述5株具高产突变株中,突变株sv一1, SV一9及sV一15连续移种5代斜面后,高产性能遗传特征稳 定,阿维拉霉素产量分别稳定在19.720.5mg/L,19.82o. 4mg/L及19.9—21.8rag,/L范围内.而SV一6及sV一13传代 生产性能不稳定稳定,随着传代次数增加,其产量下降迅速, 生产上不可行. 3结论 微波诱变对sV菌株存活率的影响研究发现,在进行微波 诱变处理时,主要是利用其非热效应. 最佳辐射时间(50s)下进行微波辐射诱变处理,阿维拉霉 素推理筛选,最终获得一株稳定性良好,阿维拉霉素产量高达 21.5mg/L,较出发菌株提高119.4%的突变株sV一15. 微波诱变技术和阿维拉霉素推理筛选法成功应用于阿维 拉霉素产生菌的选育中.在微波进行诱变的基础上,阿维拉 霉素推理筛选方法大幅度地浓缩了突变型,在很大程度上克 服了诱变随机筛选的不定向性,提高了菌种选育的工作效率. 实践证明,微波处理是一种行之有效的菌种诱变方法. 参考文献 [1]李豪,车振明.微波诱变微生物育种的研究[J].山西食品工业, 2005.(2):5—6.14 [2]贾红华.周华,韦萍.微波诱变育种研究及应用进展[J].工业微生 物,2003,33(2):46—49 [3]雷肇祖,钱志良,章健.工业菌种选育述评[J].工业微生物,2004, 34(1):39—51 l4JAa~lrupFM.JemenLB.Presence0fvariittiOI18inribosomalprotein L16~dingtomsceptihilityofenteroeoeeltonli船c}ldes (avilamycinandevemimiein).Antimiemb[J].AgentsChemother, 2000,44:3425—3427 [5]CibaLimted,Newantibioticandprocessforitsmanufacture[P]. 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