植物组织DNA的提取及纯化方法的研究

植物组织DNA的提取及纯化方法的研究 河北职业技术师范学院学报 第 13 卷第 3 期, 1999 年 9 月 2. 13 . 3 1999 Jo u rn a l o f H eb e i V o ca t io n T ech n ica l T each e r s Co llege V o lN oSep tem b e r 植物组织 的提取及纯化方法的研究DN A 33 3孙耀中 赵冬梅 毕金河 ( )河北职业技术师范学院农学系, 昌黎, 066600 , 采用高等植物 DN A 简易快速提取法, 对小麦组织 DN A 以小麦的幼芽和子房为材料摘 要 提取及纯化中的若干问题做了探讨。 研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明: 小麦幼芽是提取 DN A 的较为理想的材料; 粗提 用 酶法进行纯化, 其纯化效果较好; 纯化的幼芽稀释 8 倍即符合导入要求。DN A RN A DN A 关键词 小麦 幼芽 子房 提取 纯化 DN A 中图分类号 123946Q 外源总体 导入技术自 70 年代问世以来, 已在多种作物上得到应用。 利用该项DN A 技术, 不仅在品种间, 而且在不同科属种间可以进行性状转移; 克服远缘杂交的不亲合性; 〔1, 5〕改良作物品质; 提高作物抗逆性; 从而实现多种目标性状的转移。实践证明, 该项技术 在作物品种改良方面具有广阔的应用前景, 是一种行之有效的育种新途径。 目前, 我国在 这一领域里的研究取得了突破性的进展, 并且已有大量的报道, 但这些报道多侧重于应用方面, 而对组织 提取及纯化中的一些技术关键性问题, 则涉及较少。 本试验是在前 DN A ( ) 人研究的基础上, 结合笔者的实践 将太谷核不育小麦 导入普通小麦, 对小麦组织DN A 提取的选材、纯化方法、导入时最佳稀释倍数等问题进行探讨, 以期为这一技术的应 DN A 用和推广提供一些参考依据。 1 材料和方法 1. 1 材料 太谷核不育小麦的幼芽和子房。 太谷核不育小麦的种子用体积分数为 0101 的次氯酸钠消毒后, 再用无菌水冲洗数 次, 然后臵于搪瓷盘中, 在 25??1?恒温培养箱中培养数天, 待芽长至约 3 时, 剪下,cm 洗净后切碎, 贮放在- 20?冰箱内备用。 小麦子房取自河北职业技术师范学院标本园内刚抽出旗叶的太谷核不育小麦不育 穗, 将子房剥出, 贮放在- 20?冰箱内备用。 1. 2 方法 〔6〕 1. 2. 1 提取 参照陈永强的方法。DN A 1. 2. 2 纯化 将幼芽粗提 和子房粗提 各分成 2 份, 分别用 酶法DN A DN A DN A RN A 3 现工作单位: 河北省易县职教中心。 3 3 现工作单位: 河北省清苑县职教中心。 收稿日期: 1999- 05- 18 修改稿收到日期: 1999- 07- 14 - 1( ) ( 酶 法将 粗 提 用 10 1 ×溶 液 即 0115 〃+ 1 DN A mL SSC m o l L N aC l RN A - 1 ) 0. 015 〃柠檬酸三钠盐溶液, 710溶解, 再加入 1 的 酶 016 , ƒm o lL pH m g mL RN A mL 使 酶的质量浓度达到 60 ƒ在 37?恒温箱内保温 30 , 然后加入 3 高 , RN A ΛgmL m in mL () 氯酸钠, 再加入 12 的氯仿—异戊醇 ?= 24?1混合液, 振荡 30 后, 4000 mL V 氯仿 V 异戊醇 s ƒ离心 5 , 收集上层水溶液。在收集到的水溶液中加入预冷的体积分数为 0195 的rm in m in 乙醇, 至出现白色沉淀, 4000 离心 5 , 得沉淀物即为纯化的 将其溶于 10 ƒ, rm in m in DN A 1×中备用。mL SSC - 1() 2选择性沉降法 将粗提 用 10 013 〃溶解后, 加入预冷的 DN A mL m o lL N aA C 异丙醇 514 , 然后在 4?恒温箱内放臵 30 , 产生沉淀, 4000 离心 5 , 得沉 ƒmL m in rm in m in 淀物即为纯化的 将其溶于 10 1×中备用。, DN A mL SSC 1. 2. 3 纯度测定 采用紫外吸收光谱法。用 752 紫外可见分光光度计测定 230,DN A C D D 260 nm 260 nm () 260, 280 nm 波长处的光密度 D Κ。若 ?2. 0、?118 时, 即表明 纯度 DN A D D 230 nm280 nm 符合导入要求。 D 260nm() 1. 2. 4 的质量浓度计算×稀释倍数DN A DN A 的质量浓度 ΛgmL = ƒ0. 02×l 式中: 为比色杯厚度, 为260波长处的光密度。l D 260nm nm 2 结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 2. 1 不同纯化方法的纯化效果 就同一材料而言, 用 酶法纯化的 在 260 波长处吸收光谱的峰值明显 RN A DN A nm 高于选择性沉降法纯化的 在 260 波长处吸收光谱的峰值, 并且 酶法的DN A nm RN A D D 260 nm 260 nm ( ) 和 两个比值均大于选择性沉降法 表 1 。 这表明: 酶法对 溶液RN A DN A D 230 nm D 280 nm 中的蛋白质、酚、色素及 去除的比较干净, 而选择性沉降法对 溶液中的蛋白质RN A DN A D D 260 nm 260 nm ( ( ) ) 去除不彻底 < 2. 0, 并且 溶液中色素、酚含量较高 < 1. 8。 另外,DN A D D 230 nm 280 nm 结构 损 伤 小; 而 选 择 性 沉 降 法, RN A 酶本身是蛋白质, 所需作用条件较温和, 对 DN A N aA C 溶于水后发生水解, 生成 N aO H , 易使 DN A 二级结构发生改变, 致使 DN A 分子受 到损伤。 由此可见, 用 酶法纯化 可提高 纯度。, RN A DN A DN A 表 1 小麦幼芽和子房 在不同波长下的光密度及质量浓度DN A 波长 Κƒnm DN A 的质量浓度 D D 260 nm 260 nm 纯化方法 材料 - 1D D 230 nm 280 nm Λg〃mL ƒ230 240 250 260 270 280 01865 1048 1301 1916 1209 1010 1215 1897 1111121574. 8 幼芽 RN A 酶法 01694 01855 11201 11413 11121 01725 21036 1. 948 423. 9 子房 01815 1973 1291 1. 486 1114 1927 1823 1602 445. 8 011011幼芽 选择性沉降法 01663 01705 01939 01922 01622 11596 11701 子房1. 058 317. 4 注: 表中的 D 值为纯化的 DN A 用 1×SSC 稀释 6 倍后测得的结果。 3 期13 孙耀中等 植物组织 DN A 的提取及纯化方法的研究 2. 2 不同组织器官中 DN A 含量的比较 含量明显高于子房中同一植物不同组织器官中 含量不同, 小麦幼芽中 DN A DN A (()() 含量 表 1。究其原因: 1两种器官细胞中的内含物 如纤维素、脂类、蛋白质、有机 DN A ) 酸等不同, 幼芽生长是依靠种子中的贮藏物质, 通过一系列的呼吸作用转化为简单的可 溶物质, 并释放出大量能量, 供植物组织建成, 因此, 蛋白质含量较少。另外, 幼芽培养是在 避光条件下进行的, 次生代射产物也较少, 而子房是生殖器官的一个组成部分, 植物进入生殖生长阶段, 光合产物主要运向生殖器官, 故形成的蛋白质及代射产物相对多一些。 ( ) 2两种器官细胞的倍性存在差异, 幼芽由二倍体的体细胞构成, 而子房内含有部分单倍 体细胞, 故子房内 含量低于幼芽中的 含量。DN A DN A 2. 3 导入时最佳稀释倍数的选择DN A D 260 nm ( 纯化用 1×稀释 2, 4, 6, 8, 10 倍后, 其纯度均符合质量要求 > 210,DN A SSC D 230 nm D 260 nm 〔4〕 ) ( ) > 1. 8表 2 。据刘根齐 的研究结果: 小麦导入的质量浓度一般以 500 DN A Λg D 280 nm 左右为宜, 此浓度比较有利于导入及整合。本试验结果表明, 将纯化的小麦幼芽 mL DN A 稀释 8 倍后的浓度比较接近导入时所要求的适宜浓度。 小麦幼芽 在不同稀释倍数下的光密度及 质量浓度 表 2 DN A DN A 波长 Κnm ƒDN A 质量浓度 D D 260 nm 260 nm 稀释倍数 - 1D D 230 nm 280 nm Λg〃mL ƒ230 260 280 11011 1425 1325 1399 1830 15 2 2121242 01936 11987 11021 21123 11946 39714 4 01865 11916 11010 21215 11897 57418 6 8 01593 11368 01796 21307 11938 54712 10 01486 11243 01679 21558 11831 62115 ( ) ( ) 注: 1小麦幼芽 经 酶法纯化; 2纯化后的 用 1×溶液稀释。 DN A RN A DN A SSC 3 讨论 同一种植物不同组织器官中 的含量存在差异。 小麦幼芽中不仅含 量较DN A DN A 高, 而且含蛋白质及其它代谢产物较少, 故以小麦幼芽作为提取 的材料较为理想。DN A 就同一植物材料而言, 选用 酶法对粗提 进行纯化, 对蛋白质、酚、色素及RN A DN A 去除的比较干净, 且对 结构损伤小, 可得到符合分子遗传学上转化试验所要 RN A DN A 求的纯化的 。DN A 外源导入时, 溶液的浓度因作物不同而异。以小麦为例, 的质量浓度在DN A DN A DN A 500 ΛgmL 左右时有利于导入并易被受体细胞DN A 整合乃至表达, 进而发生变异。本试验表 ƒ 明, 纯化的太谷核不育小麦幼芽用 1×稀释 8 倍即可导入受体植株。DN A SSC 将外源太谷核不育小麦 , 在其子代中产生变异的情况, 仍在进导入普通小麦后DN A 一步观察中, 其结果另文报道。 参 考 文 献 () 1 朱新产 1 豌豆花 向小麦体中转移研究 1 作物学报, 1996, 22 3: 372, 374 DN A () 2 黄骏麒 1 外源抗枯萎病棉 导入感病棉的抗性转移 1 中国农业科学, 1986, 19 3: 26, 32DN A () 3 闫新甫 1 大麦 导入小麦产生抗白粉病变异的研究 1 遗传, 1994, 16 1: 26, 30DN A () 4 刘根齐 1 外源 直接导入小麦及其在育种上的应用 1 遗传学报, 1994, 21 6: 463, 467 DN A () 5 段晓岚 1 外源 导入水稻引起性状变异 1 中国农业科学, 1995, 28 3: 6, 9 DN A () 6 陈永强 1 植物组织 提取的一种快速方法 1 遗传, 1979 1: 39, 40DN A 第一作者简介 孙耀中: 41 岁, 男, 副教授。 STU D Y ON T H E M E T HOD S O F EX T RA C T IN G A N D PU R IF Y IN G T H E PL A N T T ISSU E DN A Su n Y ao zho n g Zh ao D o n gm e i B i J in h e ()D ep t. o f A g ro nom y, HV T C , C h an g li, 066600 , A bstra c t In th e p ap e rseve ra l p ro b lem s in ex t rac t in g an d p u r ify in g w h ea t t issu e DN A w e re an a lyzed b y th e ea sy an d qu ick p u r ify in g m e tho d s o f h igh e r p lan t DN A an d u sin g . yo u n g sp ro u t s o f w h ea t an d o ve ry ad m a te r ia lT h e re su lt s show ed th a t th e yo u n g . sp ro u t s o f w h ea t w e re th e b e t te r m a te r ia l fo r ex t rac t in g DN AA f te r DN A w a s ex t rac t2 , , ed th e yo u n g sp ro u t s o f w h ea t w e re p u r if ied b y RN A fe rm en t m e tho dth e re su lt s w e re . b e t te rO n ly th e d ilu ted e igh t t im e s p u r if ied seed lin g s DN A co u ld acco rd w ith th e de2 .m an d s , , , , , Key word s w h ea tyo u n g sp ro u to ve ryDN A ex t rac tp u r ify