2005-2014浙江大学分子生物学考博真题

2005-2014浙江大学分子生物学考博真题 2014浙大分生(甲)，主要集中在表观遗传学和基因沉默 名词解释20分: 冈崎片段:在DNA不连续复制过程中，沿着随从链模板链合成的新DNA片段，其长度在真核与原核生物当中存在差别，真核生物的冈崎片段长度约为100,200核苷酸残基，而原核生物的为1000,2000核苷酸残基。 Northern blot:将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法，被检对象为RNA,探针为DNA或RNA，用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录。 原癌基因:是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高度保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。 端粒:(Telomeres)是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，作用是保持染色体的完整性。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。端粒和细胞老化有明显的关系。 或真核细胞内线性染色体末端的一种特殊结构，由DNA简单重复序列以及同这些序列专一性结合的蛋白质构成。 1.染色体免疫共沉淀(10分):(Chromatin Immunoprecipitation，简称ChlP) 是一种在体内研究DNA和蛋白质相互作用的方法。染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来。可用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入理解DNA-蛋白质相互作用的调控网络。 ChIP的一般流程:甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。 2 在表达载体(expression vector)中标签(tag)是什么，有什么用途, 几种主要的标签(tag)及功能介绍如下: eGFP/eCFP/eYFP/mCherry 分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白标签,具有不同的激发波长和发射波长，均由野生型荧光蛋白通过基因突变和密码子优化而来。 这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点:1.不用破碎组织细胞、不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。 同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测效果更快速、简便、灵敏度高而且重现性好。4.其低消耗、高灵敏度检测的特性，十分适用于高通量的药物筛选。现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。 荧光素酶 来源于生物体内的荧光素，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶。这些荧光素酶作为“ 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 蛋白”被用于分子生物学研究中， Luciferase Assay)。跟普这种技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法( 通融合蛋白标签不同，使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究启动子、miRNA 3'UTR克隆的功能与调控，因为它们对目的基因的调控可以是渐变的，而不是简单的开和关两种状态。用于在转染过萤光素酶的细胞中检测特定启动子的转录情况或用于探测细胞内的ATP的水平;这一技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法(Luciferase Assay). 注意:荧光素酶报告基因与GFP区别 1.两者的结果检测方法不同.GFP绿色荧光蛋白,很直观,能够直接检到荧光,在普通的细胞培养条件下都能够观察到,对细胞的生命活动和其他并行的实验安排影响很小.荧光素酶报告基因使用起来比GFP多一个步骤,因为荧光素酶是个酶,不发荧光,发荧光的是它的底物,荧光素.荧光素在细胞里(要说萤火虫细胞我就不知道了哦)是没有的.所以检测荧光素酶的通常步骤是裂解细胞,释放荧光素酶,与荧光素及其他所需化学物质混合,才得到荧光.现在虽然也有活细胞内检测荧光素酶的手段,但要将荧光素送入活细胞,本身就已要对细胞进行相当的干扰.所以一般来说荧光素酶实验的同一批细胞不适合再做其他并行实验. 2.两者的结果含义不同.GFP如果说是定量检测表达蛋白的话,这个定量只能够指,表达的细 胞是多少个,不表达的细胞是多少个.GFP对于单个细胞来说,就有阳性和阴性两种结果罢了.GFP不能够定量地告诉你,这个/群细胞里的表达量是多高还是多低.荧光素酶就能够定量地得到表达量/表达水平的数值,但这个数值是相对于一群细胞来说,而不是对于单个细胞.所以荧光素酶常常用来研究启动子的功能与调控,因为启动子对基因表达的调控可以是渐变的,而不是简单的开和关两种状态. Avi Tag AviTag ?标签蛋白是一个15 个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，是多功能标签的一种。与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，作为纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。 Avi Tag标签系统具有以下几大优点:1.无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化;2.生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高;3.生物素AviTag只有15个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。 His6:His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化，是促溶解度标签的一种。 使用His-tag有下面优点:1.标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能;2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性;3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究;4.His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体;5.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和;6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag: Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，是一种促溶解度标签，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表 达系统中表达效率更高。 FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点:1.FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。3.FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blotting、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。4.融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除(DDDK)，从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。 SNAP-Tag SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。无论体内还是体外，SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团(如荧光素和若丹明)。 检测:生物素或各种颜色荧光的底物(如荧光素、若丹明)可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。 3 什么是DNA 酶足迹试验( DNA footprinting)，根据下图能得到什么结论, (主要是RNA聚合酶全酶和α2亚基与启动子区域的结合位点)(10分) DNA 酶足迹试验也叫足迹实验(footprinting assay)，是一种用来检测被特定蛋白特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构特征的实验方法。基本原理:当DNA分子中的某一区段同特异蛋白结合之后，便会得到保护而免受DNase?的切割作用，结果不会产生出相应长度的切割分子，于是在凝胶电泳放射自显影图片上便会出现一个空白区，俗称“足迹”。通过与没有蛋白保护的对照DNA序列比较，便可得知相应于足迹部位的核苷酸序列结构。 蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切 作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。 DNase I足迹试验是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。足迹试验的方法较多，常用的有DNase I足迹试验和硫酸二甲酯足迹试验(dimethylsulfate，DMS)，两者原理基本相同。 DNase I足迹试验的实验流程如下:?待检双链DNA分子用P作末端标记，通常只标记一端;?蛋白质与DNA混合，等两者结合后，加入适量的DNase I，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键断裂，并列设置未加蛋白质的对照;?从DNA上除去蛋白质，将变性的DNA加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。足迹试验特异性好，定位精确，使用广泛。 4 两种蛋白质相互作用的方法及原理,(10分) 1. 免疫共沉淀:免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。该法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。 2.双杂交技术 原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。 缺点:自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。 3.蛋白质亲和色谱 基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过该基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。 5.荧光共振能量转移技术 指两个荧光法色基团在足够近(<100埃)时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。 5 病毒介导的基因沉默及用途,(10分) 病毒诱导的基因沉默”(virus-induced gene silencing，VIGS)一词最早用于描述被病毒侵染的植物的“恢复”现象，是一种植物抗病毒侵染的自然机制，现在已被开发成通过插入目的基因片段的重组病毒抑制植物内源基因表达的遗传技术，用于基因功能分析(VIGS由小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)驱动，siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)结合后，特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合，并降解RNA模板( 在VIGS载体中插入的目的片段、重组VIGS病毒载体的植物导入方法、沉默处理时的寄主生育期、沉默处理后的植物培育条件等均显著影响VIGS的效率(作为一种新型的基因鉴定和功能研究技术工具，VIGS具有无需事先知道目的基因全长序列、获取表型迅速、无需构建转基因植株等诸多优点，已越来越广泛地被应用于植物基因功能研究和产生抗病毒植物。 6基因组DNA和cDNA在结构上的异同点,(10分) 基因组文库:是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体，它象一个储存有基因组全部序列的信息库，称为基因组文库。将生物细胞基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。这样保存的基因组是多拷贝、多片段，当需要某一片段时，可以在这样的“图书馆”中查找(没有目录)。 cDNA文库:一群含重组cDNA的细菌或噬菌体克隆群体，含有某种生物的全部的mRNA的信息。首先获得mRNA，反转录得cDNA，经克隆后形成文库。cDNA文库和基因组文库的不同之处在于，cDNA文库除却了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分，利于在原核生物中表达。其复杂性比基因文库低得多。主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序，可根据克隆cDNA分子的核酸序列直接推倒出来。 基因组文库与cDNA文库的差别: (1) 基因组文库中包含了所有的基因，而cDNA文库只包含在某一时刻某一组织表达的 基因，缺乏内元和调节序列，因此在研究基因结构时没有多大用处。 (2) cDNA文库代表了mRNA的来源，其中一些特定的转录本丰富而另一些很少，所以 存在丰度的差别;而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列。 (3) 从不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别 表达的基因;基因组文库中不能。 (4) 基因组文库由于含有不表达序列，因此比cDNA文库大。 (5) mRNA在不同的组织之间存在丰度的差异，因此cDNA文库的在构建时对于mRNA 含量较少的就比较困难;而基因组文库不存在这样的问题。 (1)基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因; (2)基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响;cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育和调控因子的影响; (3)基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子;而cDNA克隆的是不含内含子的基因。 7 拉马克认为用进废退这种后天获得的性状是可以遗传的。 如长颈鹿的祖先原本是短颈的，但是为了要吃到高树上的叶子 经常伸长脖子和前腿，通过遗传而演化为现在的长颈鹿。 “用进废退”和“获得性遗传”和达尔文进化论是相悖的， 一直没有得到认可，直至表观遗传学的发展，此问题才得以解决， 试用表观遗传学解释长颈鹿“获得性遗传”。(10分) 基因表型遗传似乎会引起人们内对“拉马克遗传说”的争论。拉马克学说认为个体后天习得的优点会“主动的”或“有意识的”传递给后代, 如长颈鹿为了在高树丛中生存, 会生育身体更高的后代。达尔文“进化论”则认为生物进化是随机突变被自然选择的结果。基因密码及突变机制的发现, 证明了进化论的正确。认真研究基因表型遗传特征的基础上, 一般认为表观遗传, 也要接受自然的选择, 它可以看作是快速、可逆的达尔文进化论, 而不是拉马克遗传机制。 8 基因的DNA遗传信息是怎样决定表型的,为什么相同DNA(不考虑突变) 可导致人具有不同的表型,(10分) 在遗传学上，把生物个体表现出来的性状叫做表现型(表型)，如头发的颜色，与表现型有关的基因组成叫做基因型。生物的表型不仅仅是DNA基因型所决定的，还有环境因素的参与。 表观遗传学(epigenetics)是指不涉及DNA 序列改变的基因或者蛋白表达的变 化， 并可以在发育和细胞增殖过程中稳定传递的遗传学分支学科. 1 表观遗传学的主要研究内容 表观遗传学其研究内容主要包括两类，一类为基因选择性转录的调控，有DNA甲基化、基因印记、组蛋白共价修饰和染色质重塑;另一类为基因转录后的调控，包括基因组中非编码RNA、微小RNA、反义RNA、内含子及核糖开关等。 1.1 DNA 甲基化 DNA 甲基化是一种常见的主要的表观遗传修饰形式。通常高甲基化抑制基因的表达，低甲基化促进基因表达。人类染色体CpG 二核苷酸是最主要的甲基化位点， DNA甲基化不仅影响基因的表达过程，而且这种影响可随细胞的有丝分裂和减数分裂遗传并持续下去。DNA 的甲基化状态在生物发育的某一阶段或细胞分化的某种状态下是可以逆转的。 1.2 组蛋白修饰 组蛋白修饰包括乙酰化、磷酸化和甲基化等， 这些修饰可影响组蛋白与DNA 双链的亲和性从而改变染色质的疏松和凝集状态，同时影响与染色质结合的蛋白质因子的亲和性， 还可影响识别特异DNA序列的转录因子与之结合的能力， 从而间接地影响基因表达，导致表型改变。不同的组蛋白氨基端修饰的组合方式构成了“组蛋白密码”，目前对组蛋白乙酰化与甲基化的研究较多， 转录活化区域组蛋白多表现出高度乙酰化状态，而去乙酰化状态通常表现为转录沉默。 1.3 非编码RNA 调控 非编码RNA指不能翻译为蛋白质的功能性RNA 分子， 具有调控作用的非编码RNA，按照它们的大小可分为长链和短链非编码RNA， 前者在基因簇以至于整个染色体水平发挥顺式调节作用。短链RNA在基因组水平调控基因表达并介导 mRNA 的降解，诱导染色质结构改变， 决定细胞的分化命运，还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身的基因组。 9 定量PCR的原理及应用(10分) PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。荧光探针定量PCR(FQ-PCR)是一种新的基因定量检测技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增(PCR)、杂交 及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床实验诊断的常规技术。 荧光探针定量PCR技术工作原理是利用Taq酶的5’ ? 3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团FAM(6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处)，靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当PCR进入延伸(复制)期，Tap酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’? 3’端外切酶活性作用，将探针切断(切口平移效应)。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测，为新的PCR定量原理创造了条件。 2014年浙江大学博士入学考试药学分子生物学试题(回忆版) 一、名词解释。(4×10) PCR:polymerase chain reaction,PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。 端粒酶,telomerase:是一种核糖核蛋白(RNP),由RNA和蛋白质组成，与其它DNA聚合酶相似，端粒酶能延伸其DNA底物的3’端，但与一般的DNA聚合酶不同，端粒酶不需要内源DNA模板指导其合成，而是以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3’端ssDNA(后随链模板)为引物，将端粒序列添加于染色体的3’端，这些新合成的DNA为单链。 质粒,plasmid:是天然存在于细菌染色体外的DNA分子，通常为环状，双链的超 螺旋结构，其变化相当大，从几个碱基对至几十万碱基对。 表型，phenotype:个体所具有的全部或部分性状(生物体表现出的形态特征和生理生化特征)，是基因型与环境作用的结果。或是指一些容易区分的个体特征的集合。 结构基因:编码RNA或蛋白质的DNA序列称为结构基因。 外显子，exon:真核基因中编码最终产物一部分的序列;其转录产物在转录后加工时仍被保留，并翻译成蛋白质或掺进RNA结构的基因部分; 突变，mutation:在基因的特定DNA序列中，其碱基组成及排列顺序可因机体内外因素的作用发生改变，导致DNA一级结构发生改变，形成基因突变。包括错义突变，无义突变，同义突变和移码突变。 或基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。 histone code:组蛋白中被修饰氨基酸的种类、位置和修饰类型被称为组蛋白密码，遗传密码的表观遗传学延伸，决定了基因表达调控的状态，并且可遗传。 histone code:distinct histone modification,on one or more tails,act sequentially,or in combination to form a” histone code “ that is ready by other proteins to bring about distinct downstream event. 二、问答。(5×12) 1.论述转基因安全性。 生物转基因工程是新兴的科学工程，目前对基因的活动方式了解还不够透彻，也没有十足的把握控制基因调整后的结果，生物转基因技术的应用的安全性问题具有许多不确定性因素，引起人们的种种疑虑，转基因食品的上市流通，对其安全性问题更疑虑重重。 一、生物转基因对食物的影响 转基因食物可能对人类健康危害有:转基因作物中的毒素可引起人类急、慢性中毒或产生致癌、致畸、致突变作用;作物中的免疫或敏感物质可使人类机体产生变态或过敏反应;转基因产品中的主要营养成分、微量营养成分及抗营养因子的变化，会降低食品的营养价值，使其营养结构失衡。不过，这些也都只是假设。 二、生物转基因对生态环境的影响 科学家担心，如果转基因作物在种植过程中， 其基因随花粉转移，并与野生杂草结合，很可能会繁殖出很难防治的“超级杂草”，这种基因转移的结果可能是产生比农田杂草更具危害的新种。 1、转基因作物对生物多样性的影响:如转基因作物在杀死害虫的同时也可能杀死害虫的天敌，可能使害虫产生抗体，如用转基因抗虫棉喂饲的害虫，其结果可能是，生物多样性的平衡发生变化，害虫本身抗性增加，其天敌数量却减少。 2、转基因作物还可能对土壤的影响:如转基因作物掠夺性地吸收土壤中的养分，可能引起土壤肥力水平逐渐降低。 转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。 首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种; 第二，延长食品保存时间或增加营养成分; 第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力， 减少了农药的使用量，有利于环境保护; 第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。 人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物， 产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。 转基因作物的大面积种植已有数年， 食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例;更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可， 食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。 2.论述基因工程的表达系统及其特点。 分为两类:原核表达系统和真核表达系统。1.原核表达系统的表达系统是原核细胞; 真核表达系统则是在真核细胞里例如酵母细胞, 昆虫细胞, 哺乳动物细胞中表达. 2.两种表达系统都是通过含有原核或者真核启动子以及其他表达相关元件的质粒系统来实现外源基因的表达. 3.原核表达系统与真核表达系统相比,表达量效率便于优化调整,表达量高. 但用来表达真核来源的外源基因时,由于蛋白折叠和糖链修饰不同,因此其应用受限. 真核表达系统表达量相对较低, 虽然酵母和昆虫系统表达量相对较高,但是在表达哺乳细胞来源基因同样存在折叠和糖链修饰的不足. 大肠杆菌表达体系(原核表达体系)的不足: 1.缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA; 2.缺乏真核细胞所特有的翻译后加工修饰系统，如糖基化，而不少具有生物活性的蛋白是糖蛋白，因此无法用原核表达系统表达; 3.细菌本身产生的热源、内毒素不易除去，产品纯化问题较多; 4.蛋白的高水平表达常形成包涵体，提取和纯化步骤繁琐，而且蛋白复性困难，易出现肽链的不正确折叠等问题。 与原核细胞表达体系相比，真核细胞表达系统表达外源基因具有下列特点:1、真核细胞可识别并切除外源基因的内含子，从而成功表达目的多肽，所以不必像原核细胞表达体系那样必须从mRNA制备cDNA。 2、真核基因在真核细胞中表达时，其S-D序列与细胞核糖体RNA(rRNA)16S亚基3’末端的互补程度较高，对翻译水平的调解有利。 3、在真核细胞内，由外源基因表达的蛋白可被糖基化，成为糖蛋白，有利于保持或提高免疫原性。 4、外源基因导入真核细胞的效率较低，其在染色体DNA上的整合是随机的和自发的，目前还无法控制整合的位置和适当的拷贝数。 5、真核细胞的培养要求较高，大量生产比较困难，成本也高。 1、通过比较，分析大肠杆菌表达系统和酵母表达系统各有何优缺点。 大肠杆菌表达外源基因的优势: ò全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架; ò基因克隆表达系统成熟、完善; ò繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定; ò被FDA批准为安全的基因工程受体生物。 大肠杆菌表达外源基因的劣势: ò缺乏对真核生物蛋白质的复性功能; ò缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统; ò内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白; ò周质内含有种类繁多的内毒素。 甲醇酵母表达系统的优点: ü 具有强的受严格调控的AOX1启动子 ü 表达蛋白的翻译后的加工和修饰 ü 营养要求低，工业化生产成本低 ü 可高密度发酵 ü 表达蛋白可存在于胞内和胞外 酵母表达系统的缺点:酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题(这个找不到，百度的) 3.分析单核苷酸多态性与体细胞突变的特点及意义。 单核苷酸多态性:不同个体间基因组DNA 序列 同一位置单个核苷酸变异(替代、插入或缺失)所引起的DNA序列多态性，群体突变频率不低于1%。SNP 是最常见的人类可遗传变异，可作为遗传标记。人基因组上平均约每1000 个核苷酸出现1 个SNP，有些SNP 与疾病有关，如镰刀型细胞贫血症，大多数SNP 与疾病无关。 基因突变既可以发生在生殖细胞，也可以发生在体细胞。体细胞突变产生的基因结构变异，尽管可能产生相应的表型，如引起疾病，但突变基因不会传递给子代。研究发现体细胞基因突变是肿瘤发生的重要分子生物学机制，所以有人认为肿瘤是一种体细胞遗传病。 基因突变改变了DNA的碱基组成，和或碱基排列顺序，但基因突变是否会造成蛋白质结构的改变，是否导致变异基因表达水平的改变，是否造成蛋白质功能紊乱以及多大程度上造成蛋白质紊乱，这些不仅与突变在基因中发生的位置有关，而且还有基因突变类型有关。因此就蛋白质而言，突变会产生多种遗传效应，包括:错义突变，无义突变，同义突变和移码突变。 4.2013年11月去世的两届诺贝尔生物学奖得主SANGER的主要科研成果及其科研思路。 2014年浙江大学 分子生物学(乙)真题回忆 1.图示基因表达过程并指出调控关键点。10分 基因表达 (gene expression):在一定调节机制控制下，基因通过转录和翻译而产生其蛋白质产物，或转录后直接产生其RNA产物，如tRNA、rRNA等的过程 。大多数基因的表达产物是蛋白质,部分基因如tRNA和rRNA基因表达产物是RNA。 基因表达调控:围绕基因表达过程中发生的各种各样的调节方式都通称为基因表 达调控.主要包括:转录水平的调控;转录后的调控;翻译水平的调控; DNA水平包括基因丢失、基因重排、染色质的结构状态。 RNA水平包括转录水平调控、RNA的转录后加工、mRNA从核内向胞浆转动、mRNA稳定性。 蛋白质水平包括翻译过程;翻译后加工的蛋白质的稳定性。 基因表达调控的多层次和复杂性 四个基本调控点(1)基因结构的活化，(2)转录起始:最有效的调节环节，(3)转录后加工及转运，(4)翻译及翻译后加工 2.蛋白质现实中以三级以上结构存在，为什么教科书中从蛋白质一、二级结构写起,10分 3.什么是siRNA、miRNA，其作用的异同点,10分 RNA干扰(RNAi)作用是生物体内的一种通过双链RNA分子在mRNA水平上诱导特异性序列基因沉默的过程。由于RNAi发生在转录后水平，所以又称为转录后基因沉默。RNA干扰是一种重要而普遍表观遗传的现象。 siRNA结构:21-23nt的双链结构，序列与靶mRNA有同源性，双链两端各有2个突出非配对的3’碱基。siRNA功能:是RNAi 作用的重要组分，是RNAi发生的中介分子。内源性siRNA是细胞能够抵御转座子、转基因和病毒的侵略 miRNA:结构:21-25nt长的单链小分子RNA ，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。特点:具有高度的保守性、时序性和组织特异性。 miRNA和siRNA都依赖于Dicer酶类的加工，但是它们的功能似乎不太相关。它们的主要区别在于:(1)成熟的miRNA是以单链形式存在的，而成熟的siRNA是双链形式存在。虽然推测miRNA具有双链RNA前体，但是在Northern印迹实验中未检测到双链RNA前体，可能是因为前体存在的时间非常短暂;(2)miRNA参与正常情况下的生长发育基因调控，而siRNA不参与生物体的正常生长，只在病毒或其他双链RNA诱导情况下才产生;(3)miRNA在转录后水平和翻译水平起作用，而siRNA为转录后水平调控;(4)Dicer酶对两类RNA的加工过程不同，miRNA为不对称加工，仅来自含茎-环结构RNA前体的一侧臂，剩余部分很快降解，而siRNA是对称来源于双链RNA的前体的两侧臂。 4.什么是γH2AX，为什么可用于DNA损伤的检测,8分 组蛋白2A变异体(histone family 2A variant，H2AX)是组蛋白H2A家族的成员之一，与组蛋白H2A家族的其它成员相比，其C末端区更长，且含有一个进化上高度保守的C末端基因序列。H2AX的独特之处在于C末端由4个氨基酸SQ(E、D)(I、L、F、Y)组成的高度保守序列，称为SQE基序[2]。当环境、代谢等因素使细胞内的染色质DNA发生双链断裂时，SQE基序的139位丝氨酸残基快速发生磷酸化形成γ-H2AX。 H2AX是最早被磷酸化的底物，在电离辐射1,2 min可以出现，30 min达到最高，γ-H2AX焦点的数量和大小与一定范围的损伤剂量相关，此外随着DSBs被逐渐修复，γ-H2AX发生去磷酸化(半衰期约为2 h)，与DNA双链断裂的修复动力学相似。所以，越来越多的研究提出γ-H2AX是DNA损伤的一个很好的蛋白标记物，可用于DNA损伤的检测。 5.解释细胞自噬过程。7分 细胞自噬(autophagy)是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程，在进化上具有高度保守性，广泛存在于从酵母、线虫、果蝇到高等脊椎动物的细胞中。根据细胞内底物进入溶酶体腔的方式不同，细胞自噬可分为大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)三种方式。 步骤1:细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore(吞噬泡)，是自噬发生的铁证之一。 步骤2:Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征:一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。 步骤3:自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合(加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的)。 步骤4:自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。 6.DNA、RNA、蛋白质相互作用的方式及涉及的分子生物学现象。10分 Crick提出中心法则。即“DNA?RNA?蛋白质”信息传递公式,是阐明细胞核内的DNA、RNA、蛋白质相互作用的方式的公式。 7.设计试验使得人源性基因在大肠杆菌中高表达。10分 大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的表达系统，由于待表达的外源基因结构具有多样性，尤其是真核生物基因的结构与大肠杆菌基因结构之间存在较大的差异，因而在构建表达系统时必须具体情况具体分析。一般来说，高效表达外源基因必须考虑以下基本原则: ?优化表达载体的设计。为了提高外源基因的表达效率，在构建表达载体时对决定转录起始的启动子和决定 mRNA 翻译的SD序列进行优化。具体方法包括组 合强启动子和强终止子;增加 SD 序列中与核糖体 16S rRNA 互补配对的碱基因序列，使 SD 序列中6,8 个碱基与核糖体16S rRNA 的碱基完全配对;根据待表达外源基因的不同情况调整 SD 序列与起始密码子 ATG 之间的距离及碱基的种类;防止核糖体结合位点附近序列转录后形成“茎环”二级结构。 ?提高稀有密码子 tRNA 的表达作用。多数密码子具有简并性，而不同基因使用密码子的频率不相同。大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性，在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁地使用。如编码 Pro 的密码子包括 CCG、CCC、CCU 和CCA 等，而其中的表达系统。第一个密码子在大肠杆菌的基因中都高频地出现，而另外三个密码子出现的频率很低。同义密码子使用的频率与细胞内相应的 tRNA 的丰度呈正相关，稀有密码子的 tRNA在细胞内的丰度很低。在 mRNA的翻译过程中，往往会由于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的 tRNA供不应求，最终使翻译过程终止或发生移码突变。此时可通过点突变等方法将外源基因中的稀有密码子转换为在受体细胞中高频出现的同义密码子。 ?提高外源基因 mRNA 的稳定性。大肠杆菌的核酸酶系统能专一性地识别外源 DNA或 RNA并对其进行降解。对于 mRNA 来说，为了保持其在宿主细胞内的稳定性，可采取两种措施，一是尽可能减少核酸外切酶可能对外源基因 mRNA的降解，二是改变外源基因 mRNA 的结构，使之不易被降解。 ?提高外源基因表达产物的稳定性。大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶，在外源基因表达产物的诱导下，蛋白水解酶的活性可能会增加。因此，须采用多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法包括:将外源基因的表达产物转 运到细胞周质或培养基中;选用某些蛋白水解酶缺陷株作为受体菌;对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修饰或改造;在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白的稳定 因子。 ?优化发酵过程。由于细菌在 100L 以上的发酵罐中的生长代谢活动与实验室条件下200mL 摇瓶中的生长代谢活动存在很大差异，在进行工业化生产时，工程菌株大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。优化发酵过程既包括工艺方面 的因素也包括生物学方面的因素。工艺方面的因素如选择合适的发酵系统或生物反应器，目前应用较多的有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器 和气升式反应器等。生物学 方面的因素包括多方面，首先是与细菌生长密切相关的条件或因素，如发酵系统中的溶氧、pH 值、温度和培养基的成分等，这些条件的改变都会影响细菌的生长及基因表达产物的稳定性。生物因素的第二方面是对外源基因表达条件的优化。在发酵罐内工程菌 生长到一定的阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。使外源基因在特异的时空进行表达不仅有利于细胞的生长代 谢，而且能提高表达产物的产率。生物因素的第三方面是提高外源基因表达产物的总量。外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。在保持单个 细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。 2. 产物本身对大肠杆菌没有毒性 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素, ?外源基因的拷贝数 ? 外源基因的表达效率 ?启动子的强弱 ?核糖体接合位点的有效性 ?SD序列和起始密码ATG的间距 ?密码子组成 ?表达产物的稳定性 ?细胞代谢负荷 ?工程菌的培养条件 或原核表达系统(大肠杆菌系统)影响外源基因表达的因素 ?启动子的强弱;?基因的剂量;?影响RNA转译效率的因 素:SD ATG mRNA ?外源基因密码子的选择;?表达产物的大小;?表达产物的稳定性。 8.什么是PM2.5,设计试验从细胞水平研究其特点及作用机制。10分 PM2.5(particulate matter2.5):细颗粒物，是指大气中直径小于或等于2.5微米的颗粒物，也称为可入肺颗粒物。PM2.5粒径小，富含大量的有毒、有害物质，且在大气中的停留时间长、输送距离远，被称为大气污染的元凶。研究发现，PM2.5会对人体的呼吸系统、心血管系统、神经系统造成很大的影响。 细颗粒物的化学成分主要包括有机碳(OC)、元素碳(EC)、硝酸盐、硫酸盐、 铵盐、钠盐(Na+)等，携带有大量的重金属和有机污染物，含苯并芘和pb等。 粒径越小吸附苯并芘的量越多，其中以PM2.5最多，PM10次之，PM2.5已经 被确定为致癌物质。 细颗粒物因为直径越小，进入呼吸道的部位越深。10μm直径的颗粒物通常沉 积在上呼吸道，2μm以下的可深入到细支气管和肺泡。细颗粒物进入人体到肺 泡后，直接影响肺的通气功能，使机体容易处在缺氧状态，引发包括哮喘、支气 管炎和心血管病等方面的疾病。 作用机制:目前主要机制有细胞凋亡，氧化损伤和钙稳态失衡等。1.激活NF-KB 引起炎症反应。2.产生ROS，诱导气氧化应激3.造成DNA损伤。 9.曹操家族基因研究发现，曹操非汉相曹参后代，同时推翻了曹操为夏侯氏抱养 而来的说法。 请你写一篇科普小 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 介绍其中的一些分子生物学知识并证明你的结论。10分 10.2013诺贝尔奖，囊泡运输的知识。15分 2013年浙江大学 分子生物学 gene:A DNA segment containing biological information and hence coding for an RNA and/or polypeptide molecule. SUMOylation:SUMO (small ubiquitin-related modifier) proteins are small protein tags that are conjugated to proteins to modify their function. The ubiquitin system tags proteins for degradation by the proteosome but SUMO conjugation has a range of other functions, stabilizing some proteins and altering their subcellular localization. Sumoylation may also influence ubiquitination and protein stability indirectly. Three different SUMO proteins are conjugated to proteins, SUMO-1, SUMO-2 and SUMO-3. 基因:是含有生物信息的DNA片段，根据这些生物信息可以编码具有生物功能的 产物，包括RNA和多肽链。 非编码RNA:指的是不被翻译成蛋白质的RNA，如tRNA, rRNA等，这些RNA 不被翻译成蛋白质，但是参与蛋白质翻译过程。 蛋白修饰: 多数蛋白质在翻译后，需要时行不同程度的共价修饰，包括磷酸化，乙酰化，甲基化，泛素化，糖基化等修饰以及N-端甲硫氨酸和信号肽的切除，二硫键形成等，称蛋白质的修饰。 基因损伤:基因遭受到内源性或处源性因素的影响，导致完整性破性，称基因损伤。 2报告基因，报告基因与转录调节的关系. 报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 (1)最常用的报告基因大多是编码抗生素抗性蛋白的基因，通过检查产物是否具有抗生素的抗性来确定基因的表达情况。 (2)β半乳糖苷酶:β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法(IPTG+X-gal)观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一. (3)荧光素酶:荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，被用作测定基因表达的报告基因。哺乳细胞无内源性荧光素酶。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达,从而 有助于分析DNA片段的转录活性。 论述题 简图分析从基因到一个有生物学功能的蛋白分子的生物学事件. 基因转录成RNA; RNA 的加工; mRNA 从胞核向胞质的转运;蛋白质翻译后修饰; 关于westernblot的，操作无误的情况下，为什么没检测到磷酸化的AKT，可能的原因. 需要考虑抗体因素，及其它试剂的原因. 样品提取过程是否有用磷酸酶抑制剂等。(一定要在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂(配方见后页)，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂). 样品放置时间太久，多次冻融降解，可使磷酸化Akt含量少，应注意现提取蛋白 现做。 设置对照样品，分析到底是样品本身就磷酸化Akt就少，还是Akt的wb做的有问题。(基础状态下没有磷酸化，样品中磷酸化Akt本身太少，不易检测) 关于诱导性多能干细胞是什么,为什么获得了2012年诺贝尔奖 分子生物学在个体化医疗中的重要贡献. 2013年浙江大学 分子生物学(乙)真题回忆 一 名词解释。 基因:A DNA segment containing biological information and hence coding for an RNA and/or polypeptide molecule. 蛋白质修饰:多数蛋白质在翻译后，需要时行不同程度的共价修饰，包括磷酸化，乙酰化，甲基化，泛素化，糖基化等修饰以及N-端甲硫氨酸和信号肽的切除，二硫键形成等，称蛋白质的修饰。 非编码rna:指的是不被翻译成蛋白质的RNA，如tRNA, rRNA等，这些RNA不被翻译成蛋白质，但是参与蛋白质翻译过程。 DNA损伤:DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为:substitutation (替换)deletion (删除)insertion (插入)exon skipping (外显子跳跃). 第二信使:能将细胞表面受体接受的细胞外信号转换为细胞内信号的物质， 称为第二信使 表观遗传学:基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。特征为可遗传性，可逆性，DNA不变性。 二 简答题。 1胞内基因差异化表达原因。 基因差异化表达包括基因表达的种类和表达的数量的差异，是由于基因的不同刺激(内源性或外源性)引起调控方式变化引起。基因组中的顺式作用元件启动子，启动子上游元件和增强子等和各种各样的的反式作用因子一起参与这一过程。基因表达的方式:组成性基因表达，适应性表达(诱导和阻遏表达)。 与表观遗传学有关。 gene expression is a very complex process that is regulated by a wide variety mechanisms. However, it appears that differential modification of certain cytosine nucleotides in gene promoter regulatory regions by methylation may be a key mechanism for regulating tissue-specific gene expression Although differentiation is not thought to occur by permanent loss of genetic material, DNA can be modified in a way that affects gene expression. For instance, DNA and its associated histone proteins (together known as chromatin) can be chemically modified by a cell's own machinery. Chromatin modification can affect gene expression by changing the accessibility of genes to transcription factors, in either a positive or a negative manner. Two major classes of such chemical modifications include DNA methylation and histone modification (methylation and/or acetylation). These changes are often described as epigenetic because they do not act to alter the primary DNA sequence but instead act at a level just above the DNA sequence. Although DNA methylation and histone modification are not genetic, cells have mechanisms to copy this epigenetic information during their division so that their daughter cells contain the same regulatory data. 2什么是表观遗传学,它与基因表达调控关系. Definition: The study of any potentially stable and, ideally, heritable change in gene expression or cellular phenotype that occurs without changes in Watson-Crick base-pairing of DNA. Epigenetic modifications leading to gene transcriptonal regulation. 真核细胞中存在着一个由RNA干扰、组蛋白结构修饰和DNA甲基化系统组成的一 个表观遗传修饰网络，能动地调控着具有组织和细胞特异性的基因表达模式。 表观遗传学变化主要集中在三大方面: DNA甲基化修饰:基因选择性转录表达的调控 非编码RNA的调控作用:基因转录后的调控 组蛋白修饰:蛋白质的翻译后修饰。 这三个方面各自影响特有的表观遗传学现象，而且它们还相互作用，共同决定复 杂的生物学过程。因此，表观遗传学也可理解为环境和遗传相互作用的一门学科。 3简述基因型与表型关系. 基因型又称遗传型,指生物的全部遗传物质(基因)组成。 但一般只表示个别或少数基因位点上的等位基因的组成。表型指生物体个别或少数性状以至全部性状的表现。基因型是生物体在适当环境条件下发育表型的内因;表型则是基因型和环境条件共同作用的结果。能遗传的是基因型，不是表型。环境因素是基因型得以发育其表型的必要条件。有时由于等位基因间或非等位基因间相互作用的影响，不同的基因型可以表现相同的表型。相反，相同的基因型也可由于基因型对环境影响有不同的反应而发育成不同的表型。基因型的这种反应特性是生物体在长期进化过程中逐渐形成的，有利于适应不同的环境条件。 4什么是代谢组学，如何进行研究, 代谢组学(Metabonomics/ Metabolomics ):通过考察生物体系(细胞，组织或生物体)受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。 也是最终产物，是一些参与生物体代谢组(metabolome):基因组的下游产物， 新陈代谢、维持生物体正常生长功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子量小于1000的内源性小分子。 代谢组学的特点:1)关注内源化合物2)对生物体系的小分子化合物进行定量定性研究3)上述化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响4)上述内源性化合物的知识可以被用于疾病的诊断和药物筛选。 研究方法 运用核磁共振(NMR)、质谱(MS)、气质联用技术(GCMS)、高效液相色谱(HPLC)等技术对细胞提取物、组织提取物和生物体液，随时间变化的代谢物浓度进行检测，结合有效的模式识别方法进行定性、定量和分类，并将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来，从而了解机体生命活动的代谢过程。 完整的代谢组学流程包括样品采集及预处理、数据采集和数据分析及解释。 1.样品采集及预处理 2.数据采集 NMR技术 迄今为止，在代谢组学研究中最常见的分析工具是NMR。能够实现对样品的非破坏性、非选择性分析，满足代谢组学中对尽可能多的化合物进行检测的目标。 质谱具有较高灵敏度和专属性，可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定。 3.数据分析及解释 代谢组学的分析目标是对生物体系中尽可能多的内源性代谢组分进行无偏差的定性定量测定，整个分析过程应尽量保留生物样品中代谢物的整体信息。 5 RNA干扰,在分生中应用, siRNA:小干扰RNA。是人工合成的短的双链RNA，它可抑制细胞内特定基因的表达，导致转录后基因失活。siRNA是RNAi的重要工具。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制。RNAi的机制可能是双链RNA进入细胞后，在Dicer酶的作用下，被切割成21,23bp大小的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs， siRNAs结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物siRNAs)， (RNA-induced silencing complex，RISC)。激活的RISC可以精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。 RNAi的应用前景(范围) 1、研究基因功能的新工具 已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。 2、研究信号传导通路的新途径 联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系.RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点，因此认为RNAi 技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。 3、开展基因治疗的新策略 RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止自私基因序列过量增殖等作用，因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。 肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。 6蛋白质高级结构,谈谈它们是如何维持的. 蛋白质的高级结构是指二级结构，三级结构和四级结构 蛋白质的二级结构:是指肽链的主链在空间的排列,或 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。 蛋白质的三级结构:是指多肽链在二级结构的基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。 蛋白质的四级结构:是指由两条或两条以上各自具有一、二、三级结构的多肽链通过非共价键(次级键)连接起来的结构形式;各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。 维系蛋白质高级结构的力:氢键Hydrogenbonds;疏水作用Hydrophobic interactions;盐键Electrostatic bonds;范德华力Van der Waals forces ;二硫键Disulfide bonds。 氢键无处不在，稳定蛋白质二级结构最主要的作用力，羰基氧与酰胺氢之间、侧链之间、侧链与水之间、主链与侧链之间、主链与水之间。蛋白质折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键，同时保持大多数成氢键的侧链处于蛋白质的表面从而与水相互作用 疏水作用:水介质中球状蛋白质的折叠注视倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部，称疏水作用。疏水作用使水与疏水残基之间发生的作用力最小，蛋白质折叠 一个首要的推动力。 盐键/离子键:正电荷和负电荷之间的静电相互作用，酸性氨基酸与碱性氨基酸之间形成。 范德华力:主要的是分散效应起作用，非极性基团间发生，包括引力和斥力。 二硫键:二硫键对蛋白质折叠为正确的高级结构起到重要的作用 7报告基因,谈谈其在基因表达研究中作用. 报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因形成融合基因，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 植物基因工程 在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种:胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(npt?)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光素酶基因等。nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。npt?、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2+、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。 动物基因工程:在动物基因表达调控的研究中，报告基因也被广泛应用。常用的有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、二氢叶酸还原酶基因、荧光素酶基因等。cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。荧光酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30,1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。 检测因子作用: 可通过报告基因的表达，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。双杂交体系是由报告基因转录调控区、报告基因及一对可以相互作用的杂合反式作用因子组成。从上述杂交体系中发展出的单一杂交体系技术，也是根据报告基因表达量的检测筛选出与已知顺式作用元件相结合的未知因子的DNA，该项技术正广泛应用于克隆细胞中含量微弱且用生化手段难以纯化的反式作用因子。 由此可知，报告基因在基因表达调控和基因工程研究中处于非常重要的地位，它是作为外源目的基因能否转化植物体的探路先锋而首先被研究的，在研究植物的基因表达调控方面起着重要的作用，现已推广到真核生物的基因调控领域中。 8为什么需要疾病模型, 人类疾病动物模型:是指医学研究中建立的具有人类疾病表现的动物实验对象和相关材料。应用动物模型是现代医学认识生命科学客观规律的实验方法和手段。通过动物模型可以直接或间接反映疾病的发生和发展过程，在了解疾病的基础上开创、改进和优化疾病的治疗。 人类各种疾病的发生发展是十分复杂的，疾病的发病机制和预防、治疗机制是不可能也不允许在人体上试验研究的，但可以通过应用动物复制出人类疾病的动物模型，对其生命现象进行研究，进而推论到人类，以便探索人类生命的奥秘，控制人类的疾病和衰老，延长人类的寿命。 应用动物模型的意义主要表现在如下几个方面:(1) 避免人体实验造成的危害(2) 应用动物模型可研究平时不易见到的疾病(3) 可提供发病率低，潜伏期和病程长的疾病的动物模型(4) 克服复杂因素，增加方法学上的可比性(5) 样品收集方便，实验结果易分析(6) 有利于更全面地认识疾病的本质。 9 谈谈如何证名Pka与蛋白X确实存在相互作用。 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了 单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。 免疫共沉淀技术 免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷:一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用;二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 pull-down技术 蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。 三 问答题 1.画图表示基因至有功能蛋白质中分生过程 一.转录(transcription) :生物体以DNA为模板合成RNA的过程 转录的基本过程:1、起始位点的识别:RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。2、转录起始3、RNA链的延伸4、转录终止 二、转录后加工 5’端加帽、3’端加尾、RNA的剪接、RNA的编辑 1、在5’端加帽 5’端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸(m7Gppp)。mRNA5’ 端的这种结构称为帽子(cap)。 2、3’端加尾--多聚腺苷酸尾巴---AAUAAA: 3、RNA的剪接 4、RNA的编辑(editing)是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。 三、蛋白质合成的过程(生物学机制) 氨基酸的活化;翻译的起始;肽链的延伸;肽链的终止;蛋白质前体的加工;四.蛋白质前体的加工 1、N端fMet或Met的切除 2、二硫键的形成 3、特定氨基酸的修饰 磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化和羧基化 4、切除新生肽链中非功能片段 五.蛋白质折叠 由核糖体合成的所有新生肽链必须通过正确的折叠才能形成动力学和热力学稳定的三位构象，从而表现出生物学活性或功能。 新生多肽?一级结构?二级结构?三级结构已经具有活性?(对于寡聚蛋白需要组装称为四级结构才有活性。 2什么是ips?为何该技术获12年诺奖 3分生在个体化医疗实践中的可能贡献。 2012浙大分子生物学试题 名词解释(3分*5) 1.The Central Dogma:克里克(F. Crick)于1958年提出的阐明遗传信息传递方向的法则，即遗传信息从DNA传递至RNA，再传递至多肽。DNA同RNA之间遗传信息的传递是双向的，而遗传信息只是单向地从核酸流向蛋白质。 2.Telomere:真核细胞内线性染色体末端的一种特殊结构，由DNA简单重复序以 及同这些序列专一性结合的蛋白质构成。 3.nuclear localization signal, NLS:亲核蛋白一般都含有的能保证整个蛋白质能够通过核孔复合体被运到细胞核内的特殊的短肽氨基酸序列。核定位信号是另一种形式的信号肽, 可位于多肽序列的任何部分。一般含有 4,8个氨基酸, 且没有专一性, 作用是帮助亲核蛋白进入细胞核。 4.Protein Motif在许多蛋白质分子中，可以发现2到3个具有二级结构的肽段，在空间上互相接近，形成一个具有特殊功能的空间结构，称为蛋白质的“模体”。 一个模体总有其特异的氨基酸序列，发挥特殊的功能，例如“锌指结构”(zinc finger)，此模体由一个α-螺旋和两个反平行的β-折叠三个肽段组成，形似手指，具有结合锌离子的功能。模体的特征性空间结构使其特殊功能的结构基础。 5.Splicesome:在剪接过程中形成的剪接复合物称为剪接体,剪接体的主要组成是蛋白质和小分子的核RNA(snRNA)。复合物的沉降系数约为50,60S,它是在剪接过程的各个阶段随着snRNA的加入而形成的。也就是说在完整的pre-mRNA 上形成的一个剪接中间体。 6.CpG岛:在基因组大部分区域中CpG序列出现频率较低，但在某些特定区域，如结构基因5’-端(启动子区)，CpG二核苷酸呈高频率成串排列，此区域称为CpG岛。 二(简答题:(5分*9) 1.一个基因有哪些结构组成, 一个基因包括两部分:在基因中用于编码RNA或蛋白质的DNA序列称为结构基因，在其两侧通常有侧翼序列，为一段不编码DNA的片段，含有基因调控序列。 结构基因 原核生物的结构基因是连续的，其RNA合成后不需要经过剪接加工，而大多数 真核生物基因则在编码区内含有非编码的插入序列，因此被称为断裂基因，其中编码序列称为外显子，非编码序列被称为内含子。在真核生物基因的外显子与内含子接头处都有一段高度保守的一致序列，即内含子以5”端大多数是以GT开始，3”大多数是以AG结束，成为GT-AG法则，可以用它作为真核基因中RNA剪接的识别信号。 非结构基因:参与转录调控的顺式作用元件，包括:启动子，增强子，沉默子和终止子。顺式作用元件是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。 启动子和上游启动子元件: 启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的启动转录的DNA序列。启动子具有方向性，位于结构基因的上游。原核生物的启动子序列具有较高的同源性，但不完全一样。真核生物的启动子元件是TATA盒，位于转录起始点上游-25bp左右处。TATA盒的核心序列是TATAAT。 上游启动子元件:是TATA盒上游的一线特定DNA序列，反式作用因子可能与这些元件结合。包括CAAT盒，CACA盒及GC盒等。 增强子:是一段短的DNA序列，其中含有多个作用元件，可以特异性地与转录因子结合，增强基因的转录活性。它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。 反应元件:一些信息分子的受体被细胞外的信息分子激活后，能与特异性DNA序列结合，调控基因的表达，由于能介导基因对细胞外的某种信号产生反应，被称为反应元件。 加尾信号:在结构基因的最后一个外显子中有一段保守的AATA AA序列，这个序列对mRNA转录终止和加尾是必不可少的，此位点下游有一段GT丰富区和T丰富区，此区和AATAAA序列共同构成poly(A)加尾信号。 2.基因、染色体、基因组的关系, 基因:A DNA segment containing biological information and hence coding for an RNA and/or polypeptide molecule. 染色体(chromosome)是细胞遗传信息载体，是高度螺旋化的染色质，易被碱 性染料染成深色，由DNA、蛋白质和少量RNA组成。 版本二:染色体是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色 质结构紧密包装的结果。 真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质(chromatin)的 形式存在的。染色质是一种纤维状结构，叫做染色质丝，它是由最基本的单位— 核小体(nucleosome)成串排列而成的。 基因组 生物体所携带的全部遗传信息，即单倍体细胞中全套染色体为一个基因 组，或是单倍体细胞中全部基因为一个基因组。 一条染色体上有许多基因，基因在染色体上呈线性排列;每一条染色体上只有一 个DNA分子，染色体是DNA分子的载体;每个DNA上有许多基因，基因是有 遗传效应的DNA片段。 3.表观遗传机制改变染色质结构的机制, Chromatin remodeling: Dynamic structural changes to the chromatin，occurring throughout the cell division cycle. These changes range from the local changes necessary for transcriptional regulation to global changes necessary for chromosome segregation. Chromatin Remodeling mechanism:1.Non-covalent manner are ATP-hydrolyzing machines,including:Chromatin remodeling complexes， Histone variants. 2. Covalent manner-Histone modification: Phosphorylation,Acetylation Methylation Ubiquitination ,small ubiquitin-related modifier (SUMOylation) Histone Modifications: change the chromatin template by cis-effects that alter internucleosomal contacts and spacing, or the trans-effects caused by histone and non-histone protein associations with the template. DNA methylation: is a type of chemical modification of DNA that can be inherited and subsequently removed without changing the original DNA sequence. function: Imprinting; X chromosome inactivation; Heterochromatin maintenance; Developmental controls; Tissue specific expression controls， 染色质重塑是由染色质重塑复合物介导的一系列以染色质上核小体变化为基本特征的生物学过程。组蛋白尾巴的化学修饰(乙酰化、甲基化及磷酸化等)可以改变染色质结构，从而影响邻近基因的活性。 4.内含子的生物学意义, 内含子是针对真核生物而言的，一种说法认为，内含子对基因的转录具有某种调控作用;另一种说法认为，内含子在生物进化的某一个阶段曾起过重要作用，内含子可能提供有关生命起源进化的大量信息。意义有:内含子有利于物种进化:内含子增加了基因的长度，提高了基因间的重组频率;内含子具有调控作用:内含子经常含有调控元件，如增强子;内含子的差别剪接可使一种基因指导合成多种蛋白; 版本二:(1)为基因表达调控提供一些辅助顺式作用元件，对基因转录效率起着修饰作用;(2)少数基因的内含子中的特殊序列可以提供不同剪切型的靶位;(3)在转录前水平上，通过影响染色质构象而调节基因转录效率(4)因不受选择压力的作用或受作用程度较小，可以较好地保留物种“进化轨迹”的部分信息;(5)对于某些基因表达调控的时序性有一定关系，内含子越长，数目越多，转录过程和成熟mRNA形成的时间也越长，这种机制可能是某些基因精确表达调控所不能缺少的(6)编码某些产物(7)表观遗传学最新研究表明，核外分子构成了一个功能强大信息缓冲区，内含子被剪切后是该信息缓冲区中的分子来源之一。 5.什么是蛋白质泛素化,其生物学意义是什么, 泛素(Ubiquitin)是一个由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链,因其广泛分布于各类细胞而得名。泛素共价地结合于底物蛋白质的赖氨酸残基，被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解。 泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程。一些特殊的酶将细胞内的蛋白质分类,从中选出靶蛋白分子。这些酶包括泛素激活酶，结合酶、连结酶和降解酶等。 泛素-蛋白酶体途径是先发现的，也是较普遍的一种内源蛋白降解方式。需要降 解的蛋白先被泛素化修饰，然后被蛋白酶体降解。不过后来又发现，并非所有泛素化修饰都会导致降解。有些泛素化会改变蛋白的活性，导致其他的生物效应。 泛素-蛋白酶体系统介导了真核生物80%~85%的蛋白质降解，该蛋白质降解途径具有依赖ATP、高效、高度选择性的特点。除参与蛋白质降解之外，泛素化修饰还可以直接影响蛋白质的活性和定位。由于泛素化修饰底物蛋白在细胞中的广泛存在，泛素化修饰可以调控包括细胞周期、细胞凋亡、转录调控、DNA损伤修复以及免疫应答等在内的多种细胞活动。在肿瘤、心血管等疾病发病中起着十分重要作用。它是近年来生物化学研究的一个重大成果，亦是研究、开发新药物的新靶点。 6.蛋白质纯化的方法, 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。 分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。 主要方法 (1)根据分子大小不同的分离方法:透析和超过滤(利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质);密度梯度离心(蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快);凝胶过滤(一种柱层析) (2)利用溶解度差别分离:等电点沉淀法:由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，此时溶解度最小，因而容易聚集沉淀;盐溶与盐析:利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度。 (3)根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离。 (4)蛋白质的选择吸附分离:利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的。 (5)根据配体特性的分离——亲和层析(利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质) (6)低温有机溶剂沉淀法: 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应 在低温下进行。 一、根据蛋白质溶解度不同的分离 1、蛋白质的盐析法:中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶;当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。 2、等电点沉淀法:蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 二、根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤:透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法: 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex ged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。 三、根据蛋白质带电性质进行分离 、电泳法:各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场1 中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。 2、离子交换层析法:离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素)，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。 四、根据配体特异性的分离方法,亲和色谱法 亲和层析法(aflinity chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体 (Ligand)的分子能特异而非共价地结合。 其基本原理:蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离(Separation)，提纯(Purification)和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。 7.MicroRNA是什么,它如何发挥作用, miRNA:是一种单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其特点就是高度的保守性、时序性和组织特异性。研究表明miRNA可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。 miRNA可能在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用。miRNA序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使其可能作为蛋白质编码mRNA的调节子，对基因表达、细胞周期调控乃至个体发育产生重要的影响。目前认为，miRNA作用的可能机制是:细胞内转录的约65nt的茎环结构的RNA前体分子前体，被Dicer,Argonaute复合物特异性识别，并加工成22nt左右的单链小RNA分子即miRNA，后者可识别并与靶mRNA序列的3-UTR互补配对，抑制其翻译过程从而调控基因表达。其中，Dicer及其同源物DCR-1是一类多结构域的RNA酶III样蛋白，对双链RNA或茎环结构RNA进行剪切，产生长度约为22nt的RNA产物。动植物的Dicer突变导致的发育缺陷，可能应归因于Dicer的突变导致其他内源性调控功能的miRNA加工失败，从而影响发育。 8.什么是全基因组关联研究(Genome Wide Association Studies,GWAS),其研究目的是什么, 全基因组关联研究是指在全基因组层面上，开展多中心、大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究，是通过对大规模的群体DNA样本进行全基因组高密度遗传标记(如SNP或CNV等)分型，从而寻找与复杂疾病相关的遗传因素的研究方法，全面揭示疾病发生、发展与治疗相关的遗传基因。 全基因组关联研究是人类基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 完成后，实施的一种对复杂性疾病，包括肿 瘤、心血管病、糖尿病、肥胖症、精神等疾病的一种成套DNA和全基因组测序和扫描的计划，试图通过测定疾病的基因变异和单核苷酸多态性，建立世界资源共享的相关疾病的基因变异数据库-dbGAP，研究确定疾病发病易感区域和相关基因，寻找疾病的标记物，进行早期诊断和最有效的个体化治疗，开发新药物和新的特异性防治措施。期望在5-10年内鉴定出人类各种重要疾病的主要基因及其变异类型。为此，美国NCI还联合组织了世界上十几个国家，组建了国际癌基因组研究团队(ICGC)，制定了“癌基因组计划”，计划对肺癌、卵巢癌、脑癌等十几种常见肿瘤，25000个样本实施全基因组序列和SNP分析。希望用十几年时间能寻找到致癌元凶，战胜绝症。人们对此寄予无限的期待和希望。 9.分子生物学研究为什么需要模式生物, 生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象，此时，这种被选定的生物物种就是模式生物，从研究模式生物得到的结论，通常可适用于其他生物。 模式生物一些基本共同点: 1)有利于回答研究者关注的问题，能够代表生物界的某一大类群; 2)对人体和环境无害，容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖; 3)世代短、子代多、遗传背景清楚; 4)容易进行实验操作，特别是具有遗传操作的手段和表型分析的方法。 在生物学发展之初，人们发现如果把关注的焦点集中在相对简单的生物上则发育的现象难题可以得到部分解答。因为这些生物的细胞数量更少，分布相对单一，变化也较好观察。由于进化的原因，细胞生命在发育的基本模式方面具有相当大的同一性，所以利用较低等级的物种来研究发育的共通规律是具有一定的可行性。尤其是当我们在有不同发育特点的生物中发现共同的形态形成和变化特征时，就可以以此来建立发育的普遍原理，因此这种生物就显得尤为重要。 在人类基因组研究中就十分注重模式生物的研究，这是由于要认识人体基因的功能，无法直接用人体作为实验对象。但是，由于生物是从共同祖先演化而来的，所以对生命活动有重要功能的基因，在进化上是保守的，也就是说，这些基因的结构和功能，在低等生物和高等生物中是相似的。因此，可以通过对模式生物基 因结构和功能的研究推测人类相应基因的功能。 三(问答题:(10分*4) 1.人体不同部位的细胞其基因组相同，为什么表达蛋白质的种类和数量不同, 在不同器官微环境下可能会引起基因修饰，造成表观遗传上的不一致，但并不改变碱基序列。真核细胞中存在着一个由RNA干扰、组蛋白结构修饰和DNA甲基化系统组成的一个表观遗传修饰网络，能动地调控着具有组织和细胞特异性的基因表达模式。机体的表观遗传模式的变化在整个发育过程中是高度有序的，也是严格受控的。 2.用分子生物学知识，谈谈疾病发生机制, 3.有一块肿瘤组织及癌旁组织，设计一个实验证明细胞内蛋白质在肿瘤发生发展中的作用, 4.目前，基因靶点研究已成为新药开发的用药部分，结合目前药物靶点在新药开发中的应用，谈谈你的建议和观点, 2011浙大分子生物学试题 英文名解 okaki fragment :在DNA不连续复制过程中，沿着随从链模板链合成的新DNA片段，其长度在真核与原核生物当中存在差别，真核生物的冈崎片段长度约为100,200核苷酸残基，而原核生物的为1000,2000核苷酸残基。 trans-acting factor :能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子。 MCS:是包含多个限制性酶切位点的一段很短的DNA序列，是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列，MCS中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。 microRNA:是一种单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其特点就是高度的保守性、时序性和组织特异性。研究表明miRNA可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。 分子伴侣:是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白，他们在细胞内能协助其他多肽结构完成正确的折叠、组装、转运和降解。 二、 简答题(每题5分) 1、 简述蛋白质的四级结构; 一级结构又称初级结构(primary structure)，指形成肽链的氨基酸序列，即指蛋白质分子中氨基酸残基的顺序，包括肽链中氨基酸的数目、种类和顺序。肽键是蛋白质中氨基酸之间的主要连接方式，即由一个氨基酸的α-氨基和另一个氨基酸的α-羧基之间脱去一分子水相互连接。 二级结构是指多肽链骨架盘绕折叠所形成的有规律性的结构。最基本的二级结构类型有α-螺旋结构和β-折叠结构，两种构象均由氢键维持。此外还有β-转角和自由回转。超二级结构是指蛋白质分子中的多肽链在三维折叠中形成有规则的二级结构聚集体。 蛋白质的三级结构是整个多肽链的三维构象，它是在二级结构的基础上，多肽链进一步折叠卷曲形成复杂的球状分子结构。 蛋白质的四级结构指数条具有独立的三级结构的多肽链通过非共价键相互连接而成的聚合体结构。在具有四级结构的蛋白质中，每一条具有三级结构的皑链称为亚基或亚单位，缺少一个亚基或亚基单独存在都不具有活性。四级结构涉及亚基在整个分子中的空间排布以及亚基之间的相互关系 2、 真核细胞基因转录的主要调控点有哪些, 3、 表观遗传学机制如何调控染色体 表观遗传学通过染色质重塑和组蛋白修饰调控染色体 染色质重塑是由染色质重塑复合物介导的一系列以染色质上核小体变化为基本特征的生物学过程。组蛋白尾巴的化学修饰(乙酰化、甲基化 及磷酸化等)可以改变染色质结构，从而影响邻近基因的活性 核小体是染色质基本组成单位, 由组蛋白和DNA 组成, 其核心与DNA紧密相连。核小体不单是DNA 的包装单位, 它与转录机制密切相关, 核小体中的组蛋白的变化对基因表型影响较大。Dr . abid Allis 曾提出过“组蛋白密码”的概念 , 指组蛋白N 端修饰方式的综合, 包括乙酰化、甲基化、磷酸化、ADP-核糖 化, 它们在基因表达、DNA 复制和染色质依赖性过程中起作用。染色质结构的改变是组蛋白共价修饰和染色质重塑复合物共同作用的结果。 组成核小体的组蛋白可以被多种化合物所修饰，如磷酸化、乙酰化和甲基化等，组蛋白的这类结构修饰可使染色质的构型发生改变，称为染色质构型重塑。 组蛋白修饰与基因表达。组蛋白中不同氨基酸残基的乙酰化一般与活化的染色质构型常染色质(euchromatin)和有表达活性的基因相关联;而组蛋白的甲基化则与浓缩的异染色质(hetero-chromatin)和表达受抑的基因相关联。乙酰化一般与活化的染色质构型相关联，乙酰化修饰大多发生在H3、H4的 Lys 残基上。甲基化-- 发生在H3、H4的 Lys 和 Arg残基上，可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的位置和程度。磷酸化-- 发生与 Ser 残基，一般与基因活化相关。泛素化-- 一般是C端Lys修饰，启动基因表达。SUMO(一种类泛素蛋白)化-- 可稳定异染色质。 染色质重塑 DNA 复制、转录、修复、重组在染色质水平发生, 这些过程中, 染色质重塑可导致核小体位置和结构的变化, 引起染色质变化。ATP 依赖的染色质重塑因子可重新定位核小体, 改变核小体结构, 共价修饰组蛋白。重塑包括多种变化, 一般指染色质特定区域对核酶稳定性的变化。染色质结构重塑存在于基因启动子中, 转录因子T F 以及染色质重塑因子与启动子上特定位点结合, 引起特定核小体位置的改变( 滑动) , 或核小体三维结构的改变, 或二者兼有, 它们都能改变染色质对核酶的敏感性 表观遗传机制 组成核小体的组蛋白可以被多种化合物所修饰，如磷酸化、乙酰化和甲基化等，组蛋白的这类结构修饰可使染色质的构型发生改变，称为染色质构型重塑。 组蛋白中不同氨基酸残基的乙酰化一般与活化的染色质构型常染色质(euchromatin)和有表达活性的基因相关联;而组蛋白的甲基化则与浓缩的异染色质(hetero-chromatin)和表达受抑的基因相关联。组蛋白的乙酰化中和赖氨酸的正电荷，C=O具有一定的负电，能够增加与DNA的斥力，使得DNA结构变得疏松，从而导致基因的转录活化。组蛋白甲基化可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的赖氨酸处于什么位置。特定组蛋白羧基端的泛素化同样影响蛋白质的降解过程，从而也可调节基因的表达。 4、 简述真核细胞中RNA聚合酶的类型及功能; 真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较 转录产相对活对α-鹅膏蕈碱 酶 位置 物 性 的敏感性 RNA聚 核仁 rRNA 50-70% 不敏感 合酶? RNA聚 核质 hnRNA 20-40% 敏感 合酶? RNA聚存在物种特异 核质 tRNA 约10% 合酶? 性 真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。模板理论(piecing theory) 一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性、有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。 5、 真核生物RNA的类型; 真核生物mRNA结构的特点:(1)5‘端有帽子结构。即7,甲基鸟嘌呤,三磷酸鸟苷m7GpppN。 (2)3‘端大多数带有多聚腺苷酸尾巴。 (3)分子中可能有修饰碱基，主要有甲基化。 (4)分子中有编码区和非编码区。 tRNA的结构特点(1)tRNA是单链小分子。(2)tRNA含有很多稀有碱基。(3) tRNA的5‘端总是磷酸化，5’末端核苷酸往往是pG.(4)tRNA的3‘端是CCA,OH序列。是氨基酸的结合部位。(5)tRNA的二级结构形状类似于三叶草，含二氢尿嘧啶环(D环)、T环和反密码子环。(6)tRNA的三级结构是倒L型。D环和T环在L的拐角上。 rRNA(1)rRNA是细胞内含量最丰富的RNA，它们与核糖体蛋白共同构成核糖体， 后者是蛋白质合成的场所。(2) 核糖体和rRNA一般都用沉降系数S表示大小。原核生物核糖体的沉降系数为70S，由50S和30S两个大小亚基组成，30S小亚基含有16SrRNA和21种蛋白质。50S大亚基含有23S和5SrRNA以及34种蛋白质。真核生物沉降系数为80S，由大小亚基组成。40S小亚基含有18SrRNA和30多种蛋白质。60SrRNA含有5S、5.8S和28SrRNA 以及大约45种蛋白质。 miRNA:是一种单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其特点就是高度的保守性、时序性和组织特异性。研究表明miRNA可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。 siRNA:小干扰RNA。是人工合成的短的双链RNA，它可抑制细胞内特定基因的表达，导致转录后基因失活。siRNA是RNAi的重要工具。 反义RNA:碱基序列正好和有意义mRNA互补的RNA称为反义RNA。这类RNA也是单链RNA，可与mRNA配对形成双链，最终抑制mRNA作为模板进行翻译，这是反义RNA主要的调控功能。 6、 什么是基因突变,真核细胞基因突变的主要类型, gene mutation:基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。 突变类型:?点突变:DNA大分子上一个碱基的变异。分为转换和颠换。?缺失:一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。?插入:一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链插入到DNA大分子中间。?倒位:DNA链内重组，使其中一段方向倒置。 版本二 突变的分子改变类型:(1)错配:DNA分子上的碱基配对又称点突变。(2) 缺失，插入和框移:缺失和插入都可以导致框移突变。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同。(3)重排:DNA分子中较大片断的交换，称为重组或重排。 突变的遗传效应:?遗传密码的改变:错义突变、无义突变、同义突变、移码突变?对mRNA剪接的影响:一是使原来的剪接位点消失;二是产生新的剪接位点。?蛋白质肽链中的片段缺失. 突变的意义:(1)突变是进化、分化的分子基础。(2)只有基因型改变的突变。 (3)致死性的突变(4)突变是某些疾病的发病基础。 7、 什么是"组学",常有的组学技术有哪些, 分子生物学中，组学(Omics)主要包括基因组学(Genomics)，蛋白组学(Proteinomics)，代谢组学(Metabolomics)，转录组学(transcriptomics)，脂类组学(lipidomics)， 免疫组学(Immunomics)，糖组学(glycomics )和 RNA组学(RNomics)学等。 基因组学(Genomics)，指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱)，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。基因组研究应该包括两方面的内容:以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学，又被称为后基因组(postgenome)研究。 蛋白质组(proteome)指全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式，是一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。 蛋白质组学(proteomics)是对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。它从蛋白质水平上探索蛋白质的作用模式，为功能机理、调节控制、药物开发、新陈代谢途径等提供理论依据和基础。 功能基因组学(Functuional genomics)又称为后基因组学(Postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。 8、 简述兔源多克隆抗体的制备过程; 多克隆抗体制备流程 (一)免疫原的制备 免疫原(immunogen)指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性。 (二)免疫动物 免疫动物的选择:?抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，?动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物(以雄性为佳)。?抗原性质与动物种类 免疫方法:选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间隔等因素。免疫原的剂量:免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。 (2) 免疫途径与免疫间隔时间 免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免疫 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 而异。免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因 素，其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以10,20天为佳，二次后间隔时间一般为7,10天，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。 (三)免疫血清的收集 采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。 (四)免疫血清的鉴定 效价的测定:颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。 (五)免疫血清的保存1、4?保存(6个月)2、低温保存(-70 ? ,-20 ? ，5年)3、真空干燥保存(5 , 10年) 兔多克隆抗体的制备: 选取正常家兔或新西兰大白兔 第一次 抗原+完全佐剂共2ml 皮下 多点免疫 3-4周后,第二次免疫 抗原+不完全佐剂 2ml 皮下多点免疫 7天后测效价或第三次免疫后测,第三次和第二次免疫相同 第二次免疫3周后冲击免疫 放血收集血清 9、 研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法有哪些, 一、酵母双杂交系统:是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发 展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术:是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于 病毒粒子内。 或噬菌体表面展示(surface display)是一种基因表达筛选技术。即将目的基因克隆在特定的表达载体中，使基因表达产物呈现在活的噬菌体、细菌或细胞的表面，由此可直接检测表达产物的某些活性，并可根据其活性筛选、富集和克隆带有目的基因的噬菌体或细胞 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术:表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术:当供体荧光分子的发射光谱与受荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大增强(敏化荧光)。FRET技术能对在固定细胞中的蛋白质间相互作用或存在于活细蛋白质间实时相互作用进行原位分析及动态研究。 荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光 显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白(GFP)的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术 蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变。微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，它也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。 蛋白芯质片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗菌素的蛋白质或其他成分与芯片作用，漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，并最终达到测定各种蛋白质功能的目的。 六、免疫共沉淀技术 免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷:一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用;二是必须在实验前预测目的蛋白是什 么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 七、pull-down技术 蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。 串联亲和纯化技术(tandem afinity purification，TAP)，与其他融合标签方法的最大不同是该方法选用了两个连续的标签而不是通常意义上的一个。标签共分三部分:蛋白A、CBP(calmodulin binding peptide，钙调素结合多肽)和中间连接的TEV酶识别的酶切位点。带有TAP标签的融合蛋白在细胞中表达与内源相互作用蛋白形成复合物，细胞裂解后经IgG偶联的层析柱纯化，蛋白A与IgG特异结合，从而使含有标签的复合物得到第一次纯化。为提高特异性用TEV酶切割后，进行第二次纯化。纯化后的复合物经SDS-PAGE后，切胶后经处理即可通过质谱鉴定复合物中各成份的氨基酸顺序。 三、 问答题(每题10分) 1、 什么是蛋白质修饰,细胞内蛋白质修饰主要类型有哪些,其主要功能是什么, 蛋白质修饰:多数蛋白质在翻译后，需要时行不同程度的共价修饰，包括磷酸化，乙酰化，甲基化，泛素化，糖基化等修饰以及N-端甲硫氨酸和信号肽的切除，二硫键形成等，称蛋白质的修饰。 细胞内蛋白质修饰主要类型:Removal of N-Met，Disulfide bond formation Chemical modifications: Phosphorylation (磷酸化)，Acetylation (乙酰化)，Methylation (甲基化)，Ubiquitination (泛素化)，SUMOylation (small ubiquitin-related modifier) ，Glycosylation (糖基化)，Myristylation (十四烷基化) and Farnesylation (法尼基化) 主要功能 1.Regulation of activity: turn activity on，turn activity off 2.generate a different function :Protein-protein interaction ，modification site may be a binding interface3.Subcellular localization :modification site may be a targeting signal ，modification may be a membrane anchor 4.Degradation:identify the protein for degradation Phosphorylation :Most common posttranslational modification to proteins in eukaryotes Enzymes and regulators are turned ‘on’ and ‘off’ Acetylation/Deacetylation:modify protein activity; crosstalk with phosphorylation, methylation, ubiquitination, sumoylation, and others for dynamic control of cellular signaling DNA methylation: typically occurs at CpG sites in vertebrates serves in epigenetic gene regulation: Methylation at different sites of histones may have different function on gene expression: activation or repression. Ubiquitination: Mono-ubiquitination-Regulation: endocytosis, gene expression, protein sorting, subnuclear Multi-ubiquitination -Protein degradation trafficking . SUMOylation:SUMO (small ubiquitin-related modifier) proteins are small protein tags that are conjugated to proteins to modify their function. The ubiquitin system tags proteins for degradation by the proteosome but SUMO conjugation has a range of other functions, stabilizing some proteins and altering their subcellular localization. Sumoylation may also influence ubiquitination and protein stability indirectly. Three different SUMO proteins are conjugated to proteins, SUMO-1, SUMO-2 and SUMO-3. Functions of glycosylation Proper folding ,Stabilise proteins against proteolysis,Form ECM (extracellular matrix) 胞外基质Modulation of immune response, Selectins bind to oligosaccharides, cell-cell interactions Anchor proteins on membrane 锚定作用 2、 大规模临床证据显示非受体酪氨酸磷酸酶在乳腺肿瘤转移灶组织中高表 请设计一个实验研究方案在细胞水平探讨该蛋白在肿瘤发生、转移过程中的达。 可能作用。 3、 什么是模式生物,为什么医学研究中需要模式生物, 模式生物(Model Organism)，作为实验模型以研究特定生物学现象，揭示某种具有普遍规律的生命现象的动物、植物和微生物，从研究模式生物得到的结论，通常可适用于其他生物。作为模式生物，它们有一些基本的共同点，即有利于回答研究者关注的问题，能够代表生物界的某一大群;对人体和环境无害，容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖;世代短、子代少、遗传背景清楚;容易进行实验操作，特别是具有遗传操作的手段和表型分析的方法。而选择什么样的生物作为模式生物主要是依赖于研究者要解决什么科学问题，然后寻找能最有利于解决这个问题的物种。 在生物学发展之初，人们发现如果把关注的焦点集中在相对简单的生物上则发育的现象难题可以得到部分解答。因为这些生物的细胞数量更少，分布相对单一，变化也较好观察。并且由于进化的原因，细胞生命在发育的基本模式方面具有相当大的同一性，所以利用较低等级的物种来研究发育的共通规律是具有一定的可行性。尤其是当我们在有不同发育特点的生物中发现共同的形态形成和变化特征时，就可以以此来建立发育的普遍原理，因此这种生物就显得尤为重要，我们称之为“模式生物”。因为对它们的研究可以帮助我们理解生命世界的一般规律。目前一些物种被大家公认为是优良的模式生物，如线虫、果蝇、非洲爪蟾、蝾螈、小鼠、斑马鱼、噬菌体、大肠杆菌、酿酒酵母、海胆等。它们在人口与健康领域应用范围比较广。而在植物学研究中比较常用的有，拟南芥、水稻、烟草等。 模式生物在科学研究中具有重要的作用。例如在人类基因组研究中就十分注重模式生物的研究，这是由于要认识人体基因的功能，无法直接用人体作为实验对象。但是，由于生物是从共同祖先演化而来的，所以对生命活动有重要功能的基因在进化上是保守的，也就是说，这些基因的结构和功能，在低等生物和高等生物中是相似的。因此，可以通过对模式生物基因结构和功能的研究推测人类相应基因的功能。 4、 结合你的实际经历和知识背景，谈谈分子生物学在医学中的作用。 2010浙大分子生物学试题 一名词解释 基因组:生物体所携带的全部遗传信息，即单倍体细胞中全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中全部基因为一个基因组。 基因治疗:一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的治疗方法。 半保留复制:即DNA复制时亲代DNA的两条链解开，每条链作为新链的模板，从而形成两个子代DNA分子，每一个子代DNA分子包含一条亲代链和一条新合成的链。 基因诊断:又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。 ncRNA:指的是不被翻译成蛋白质的RNA，如tRNA, rRNA等，这些RNA不被翻译成蛋白质，但是参与蛋白质翻译过程。 二简答题 细胞死亡的方式有哪些, necrosis (not programmed) 是以酶溶性变化为特点的活体内局部组织细胞的死亡。坏死可因致病因素较强而直接导致，但大多数由可逆性损伤发展而来，其基本表现是细胞肿胀、细胞器崩解和蛋白质变性。炎症时，坏死细胞及周同渗出的中性粒细胞释放溶酶体酶(可促进坏死的进一步发生和局部实质细胞溶解，因此坏死常同时累及多个细胞。 apoptosis (Type I cell death):指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 autophagy (Type II cell death):characterized by the formation of large vacuoles which eat away organelles in a specific sequence prior to the nucleus being destroyed. 细胞自噬(autophagy)是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过 程，在进化上具有高度保守性，广泛存在于从酵母、线虫、果蝇到高等脊椎动物的细胞中。 或自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。 程序性细胞死亡的共同点在于它们是细胞主动的死亡过程，能够被细胞信号转导的抑制剂阻断，而非程序性细胞死亡则是细胞被动的死亡过程，不能被细胞信号转导的抑制剂阻断。 caspase-independent programmed cell-death Necroptosis 疾病模型与模式 人类疾病动物模型(animal model of human diseases)是指医学研究中建立的具有人类疾病表现的动物实验对象和相关材料。应用动物模型是现代医学认识生命科学客观规律的实验方法和手段。 干细胞的应用前景如何 基因转录，基因翻译和基因表达的区别 基因表达 (gene expression):在一定调节机制控制下，基因通过转录和翻译而产生其蛋白质产物，或转录后直接产生其RNA产物，如tRNA、rRNA等的过程。 转录(transcription) :生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。 基因翻译:指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。 什么是DNA损伤，如何被发现, DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为:substitutation (替换)deletion (删除)insertion (插入)exon skipping (外显子跳跃) 大部分DNA损伤修复都依赖于DNA的修复合成,所以对修复合成的测定常用来作为DNA修复的检测方法。常用的有以下几种: a放射自显影法:在细胞培养物中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷等放射源,用放射 自显影方法计数银颗粒数来测定修复合成过程中参入到DNA分子中的量。 b液体闪烁计数法 :用液体闪烁计数器测定培养物中的放射源因修复合成而参入到DNA分子中的量。这一方法适用于大批量样本。 c超速离心法:一种应用比较广泛的方法，可应用于切除修复、复制后修复及链断裂修复方式的检测。一般是用氚标记溴脱氧尿嘧啶核苷等参入到修复合成的DNA分子中去以改变DNA分子的重量(BrdU的分子量比尿嘧啶核苷大),通过超速离心可以从沉降系数不同的各组分中收集修复合成中参入量不同的DNA片断,然后分别测定其放射性的强度来判断修复合成的多少。 d病毒宿主细胞复活法: 以SV40病毒、腺病毒、疱疹病毒、噬菌体等感染培养的人体细胞或细菌，然后以紫外线等处理以造成病毒DNA分子的损伤，因为病毒DNA分子损伤的修复是靠宿主细胞的修复酶系统，所以受损伤的病毒能否继续生存繁殖可间接地反映宿主细胞的修复功能。 e姐妹染色单体互换(SCE)法: 姐妹染色单体互换率的检测也能反映一部分DNA修复功能。人类中的某些先天性DNA修复缺陷疾病如布卢姆氏综合征患者的自发SCE显著增高;另一些如着色性干皮病则诱发SCE增高。这是由于DNA修复功能的缺陷导致染色体稳定性减弱所致。 蛋白质稳定结构的非共价键是什么,蛋白质与蛋白质之间如何连接 蛋白质的特性有哪些,如何鉴定 为什么基因组相同而蛋白质组不同, 三论述题 1.端粒和端粒酶的发现，何以获得2009诺贝尔医学奖 端粒为存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，与端粒结合蛋白一起构成特殊的“帽子”结构，用于维持染色体的完整性。端粒与细胞老化有明显关系，DNA 复制一次，端粒缩短一点。一旦端粒耗尽，染色体易于突变而导致动脉硬化及某些癌症。端粒DNA 由简单DNA 高度重复序列组成，染色体末端沿5'?3'方向富含GT，并有许多蛋白与端粒DNA 结合。端粒DNA 主要功能:保护染色体不被核酸酶降解;防止染色体相互融合;为端粒酶提供底物，解决DNA 复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。 端粒酶,telomerase:是一种核糖核蛋白(RNP),由RNA和蛋白质组成，与其它 DNA聚合酶相似，端粒酶能延伸其DNA底物的3’端，但与一般的DNA聚合酶不同，端粒酶不需要内源DNA模板指导其合成，而是以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3’端ssDNA(后随链模板)为引物，将端粒序列添加于染色体的3’端，这些新合成的DNA为单链。 获得2009诺贝尔医学奖原因 在新细胞中，细胞每分裂一次，端粒就缩短一次，当端粒不能再缩短时，细胞就无法继续分裂而死亡。端粒酶解决了困扰科学家的DNA半保留复制时5‘末端产生的空缺问题。因为DNA半保留复制时真核生物不能像原核生物那样填补5’端的空缺，从而会使5‘末端缩短。端粒酶可以外加重复单位到5’端上，结果使端粒维持一定的长度。端粒有长短，随着年龄增加而越来越短，端粒的消失，会使染色体发生畸变，从而使人类细胞丧失复制能力，最终导致细胞衰老。端粒在决定细胞寿命上起着重要的作用。端粒酶，在一些失控的恶性细胞的生长中扮演重要角色。大约90%的癌细胞都有着不断增长的端粒及相对来说数量较多的端粒酶，因此端粒酶可作为抗癌治疗的靶位点。 2.表观遗传效应说明什么, 3.转化医学是什么,对其发展，你如何看待 转化医学是一种医学研究，试图在基础研究和临床治疗之间建立更直接的关系，把生物医学的研究成果转化为有前景的新型诊断试验、治疗及药物。 从上述定义可以看出，转化医学倡导以患者为中心，从临床工作中发现和提出问题，由基础研究人员进行深入研究，然后再将基础科研成果快速转向临床应用，基础与临床科技工作者密切合作，以提高医疗总体水平。因此转化医学研究主张打破以往研究课题组单一学科或有限合作的模式，强调多学科组成课题攻关小组，发挥各自优势，通力合作。 根据美国FDA的资料，临床前作用良好的新药，只有30%能通过III期临床试验。更多的药物由于药物的毒性、体内分布等种种原因，没有体现出比现有药物更好的疗效而遭淘汰。为了降低新药开发的巨大风险，就需要转化医学的研究，比较动物实验与人体临床研究的差异，加快新药的研发速度。 传统的基础研究与临床实践被一系列的障碍分隔，这些障碍就像“篱笆墙”。新药的研发隔离于临床在实验室中进行，而当需要进行安全测试和临床试验时才不 可避免地被“扔过篱笆”。许多制药公司正在建立转化医学团队，来增强基础研究和临床医学的沟通。 4.设计一个证明信号传导机制的试验方案。 2009浙大分子生物学试题 名词解释: 1. 癌基因和抑制癌基因: 癌基因是指其编码的产物与细胞的肿瘤性转化有关的基因，它以显性的方式作用对细胞生长起阳性作用并促进细胞转化; 抑癌基因也称为抗癌基因,正常细胞中存在基因,在被激活情况下它们具有抑制细胞增殖作用, 正常情况下它们对细胞的发育生长和分化的调节起重要作用，但在一定情况下被抑制或丢失后可减弱甚至消除抑癌作用的基因。 2. 顺式作用元件和反式作用因子:影响自身基因表达活性的非编码DNA序列， 例如启动子、增强子、弱化子等称cis-acting element。能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为trans-acting factors。 3. 遗传表观学性状 4. 基因表达:在一定调节机制控制下，基因通过转录和翻译而产生其蛋白质产物，或转录后直接产生其RNA产物，如tRNA、rRNA等的过程 。 5. 系谱分析:是了解遗传病的一个常用的方法。其基本程序是先对某家族各成员出现的某种遗传病的情况进行详细的调查，再以特定的符号和格式绘制成反映家族各成员相互关系和发生情况的图解，然后根据孟德尔定律对各成员的表现型和基因型进行分析。通过分析，可以判断某种性状或遗传病是属于哪一种遗传方式(单基因遗传、多基因遗传)。如果是单基因遗传，还可确定是显性、隐性或性连锁遗传。 简答题: 1. 试述基因和基因组，蛋白质和蛋白质组; 基因是含有生物信息的DNA片段，根据这些生物信息可以编码具有生物功能的产物，包括RNA和多肽链。 基因组是指一个物种的单倍体染色体数目及所包含的全部遗传物质，称为该物种 的基因组。换句话说，基因组是细胞或生物体中一套完整单倍体遗传物质的总称。蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链,并经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。 蛋白质组(proteome)指全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式，是一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。 2. 基因工程的工具; 分子克隆常用的工具酶:一、限制性核酸内切酶:是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。分类:可分为?、?、?型三大类。?型酶作用特点:只有限制性活性，无甲基化活性;只需Mg++作为催化反应辅助因子，无须,,,。识别顺序一般为4,6个碱基，通常是回文结构(反转重复顺序)，即具有180?的旋转对称。二、DNA连接酶(DNA Ligase):T4 DNA Ligase。催化两个独立双链DNA片段5’-磷酸基和3’-羟基之间形成磷酸二酯键;修复双链DNA中一条链上的缺口。三、DNA聚合酶(DNA Polymerase)1、DNA polymerase I (全酶，Kornberg polymerase)具有至少3种活性: 5’,3’聚合酶活性;5’, 3’外切酶活性;3’, 5’外切酶活性。应用:1、催化DNA缺口平移(nick translation)反应，制备高比活DNA探针;2. 第二cDNA链合成3. 对双链DNA3’突出末端进行末端标记;4. Sanger 测序 2、大肠杆菌DNA聚合酶?klenow片段:5’,3’聚合酶;3’, 5’外切酶;缺失5’,3’外切酶活性 应用:全酶第2-4。四、逆转录酶 (reverse transcriptase)依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称cDNA(complementary DNA)。用于mRNA为模板合成cDNA，是构建cDNA文库和RT-PCR技术中的关键工具酶。五、末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT):将dNTP加到DNA3’羟基。作用:?3’端标记DNA探针?在载体和待克隆片段上形成同聚物尾，以利DNA重组。六、碱性磷酸酶(AP): 催化去除DNA、RNA、NTP及dNTP的5’磷酸基团。1. 在用32P标记5’末端前，去除DNA或RNA的5’磷酸基;2. 在连接反应中，去除载体DNA片段5’磷酸基，防止自身环化。 常用的工具酶 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶? 探针标记、补平3′末端 反转录酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记 末端转移酶 3′末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 3. 基因表达的主要过程及调控的主要位点; 基因表达调控可在多个层面进行: 基因转录成RNA; RNA 的加工; mRNA 从胞核向胞质的转运; mRNA的降解; 蛋白质翻译后修饰; 蛋白质降解。其中, 基因转录水平的调节最为关键。 4. 设计一个实验证明DNA是遗传物质; Fred Griffith 肺炎双球菌体内转化实验。肺炎双球菌是一种致病菌，存在无毒的R 型及剧毒的S 型。活的、无毒的R 菌注入小鼠体内，小鼠不死亡;活的、剧毒的S 菌注入小鼠体内，小鼠死亡;加热杀死的S 菌注入小鼠体内，小鼠不死亡; 大量加热杀死的S 菌及少量活的、无毒的R 菌一起注入小鼠体内，小鼠死亡，并分离出有活性的S 菌。得出结论:加热杀死的S 菌有一种“转化因子”能使R菌转化为S 菌，使小鼠致死。肺炎双球菌转化实验为DNA 是遗传物质奠定了基础。(需要补充) 5. 蛋白质翻译后加工的内容; 6. 举例说明蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法; 7. 单核苷酸多态性; 单核苷酸多态性:个体间基因组DNA序列同一位置单个核苷酸变异(替代、插入或缺失)所引起的DNA序列多态性，群体突变频率不低于1%。SNP 是最常见的人类可遗传变异，可作为遗传标记。人基因组上平均约每1000 个核苷酸出现1 个SNP，有些SNP与疾病有关，如镰刀型细胞贫血症，大多数SNP 与疾病无关。 8. 基因突变及生物学意义; 基因突变:基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象(gene mutation)。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。 突变的意义:(1)突变是进化、分化的分子基础。 (2)只有基因型改变的突变。(3)致死性的突变。(4)突变是某些疾病的发病基础。 9. 蛋白质结构和疾病的关系。 问答题(,个): 1. 根据国内外进展，说明分子生物学与医学的关系 2. 举例说明蛋白质结构和功能的关系 3. 结合环境污染，举例环境污染与基因的关系说明疾病的发生机制 4.某信号,与血管内皮细胞经蛋白,可发生信号转导，设计一个实验说明细胞内与蛋白,发生相互作用的蛋白 2008浙大分子生物学试题 名词解释: 1. 信号肽:能启动蛋白质运转的任何一段多肽，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列(有时不一定在N端)。信号序列特点:一般带有10-15个疏水氨基酸;在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸;在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链(丙氨酸或甘氨酸)。 2. 蛋白质超二级结构:是指多肽链内顺序上互相靠近的二级结构单元在空间上进一步靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体。目前发现的超二级结构有三种形式:αα、βαβ、βββ，超二级结构的形成主要是组成他们的氨基酸残基侧链基团相互作用的结果。 3. 基因组:是指一个物种的单倍体染色体数目及所包含的全部遗传物质，称为该物种的基因组。换句话说，基因组是细胞或生物体中一套完整单倍体遗传物质的总称。 4. 核酸分子杂交:是核酸研究中一项最基本的实验技术。互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。 5. 反式作用因子: 是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。 6. 操纵子 : 是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区(包括启动子和操纵基因)以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位. 7. 基因表达: 在一定调节机制控制下，基因通过转录和翻译而产生其蛋白质产物，或转录后直接产生其RNA产物，如tRNA、rRNA等的过程 。 8. 微卫星DNA:又称为简单重复顺序(Simple Sequence Repeats， SSR)，是由几个核苷酸(2,6个)为重复单位组成的长达几十到几百个核苷酸的重复序列如(GA)n，(AC)n，(GAA)n等，在染色体上呈随机分布，由于重复次数不同及重复程度的不完全而造成了每个座位的多态性。 9. 逆转录 : 10. 管家基因:某些基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因. 11. 基因打靶: 是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。 12. 基因治疗: 是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。 2.问答题 DNA复制的基本特点和要点 大致分为复制起始，延伸和终止三个阶段。以原核生物DNA 复制为例: (1)复制起始:DNA 双螺旋的解旋。DNA 复制时，其双链首先解开，形成复制叉，复制叉的形成由多种蛋白质及酶参与。a、DNA 解旋酶:解开双链。大部分DNA 解旋酶沿5'?3'方向随复制叉前移，个别解旋酶(Rep 蛋白)沿3'?5'方向移动，可能是Rep 蛋白和特定DNA 解链酶分别在两条母链上协同作用以解开双链。b、单链结合蛋白(SSB):SSB 结合在打开的单链上以稳定单链，不参与 解旋。c、DNA 拓扑异构酶:解开随着复制叉打开而形成的超螺旋，使复制得以继续。d、引物合成酶:合成一段RNA 引物，引发DNA 复制。 (2)DNA 链延伸:在DNA pol ?的作用下，沿3'?5'方向的模板链可连续合成DNA，新合成的链称为前导链，沿5'?3'方向的模板链不能连续合成DNA，只能随着复制叉的打开合成冈崎片段，新合成的链称为后随链。 (3)DNA 链终止:前导链是连续的，由DNA pol I(5'?3'聚合酶活性、3'?5'外切酶活性、5'?3'外切酶活性)通过其5'?3'外切酶活性切除RNA 引物。后随链是不连续的，有许多冈崎片段。RNase H(内切酶)降解RNA 引物，DNA pol I 利用后一个冈崎片段为引物，通过其5'?3'聚合酶活性合成DNA 补齐缺口，并由DNA 连接酶催化形成磷酸二酯键连接冈崎片段形成完整的后随链。 G蛋白的信号转导机制和意义 DNA的损伤有几类?相应的修复机制是什么 DNA修复(DNA repairing)是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能;但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这种DNA的损伤而能继续生存。原核和真核生物对于DNA的损伤都有很多的修复系统，如SOS系统。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。 (一)直接(回复)修复 这是较简单的修复方式，一般都能将DNA修复到原样。 1、光修复(photoreaction repair) 这是最早发现的DNA修复方式。修复是由细菌中的DNA光解酶(光复活酶)(photolyase)完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光;结合后如受300,600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中，人体细胞中也有发现。 2、烷基的转移 在细胞中发现有一种O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶，能直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。这个酶的修复能力并不很强，但在低剂量烷化剂作用下能诱导出此酶的修复活性。 (二)切除修复(excision repair)是修复DNA损伤最为普遍的方式，对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都 能起修复作用。这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的DNA修复机制。修复过程需要多种酶的一系列作用，?首先由核酸酶识别DNA的损伤位点，在损伤部位的5′侧切开磷酸二酯键。不同的DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割。?由5′?3′核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除。?在DNA聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按5′?3′方向合成DNA链，填补已切除的空隙。?由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构。 (三)重组修复(recombinational repair) 上述的切除修复在切除损伤段落后是以原来正确的互补链为模板来合成新的段落而做到修复的。但在某些情况下没有互补链可以直接利用，例如在DNA复制进行时发生DNA损伤，此时DNA两条链已经分开，其修复可用DNA重组方式:?受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口。?另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换，将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处，而母链DNA出现缺口。?以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口，最后由DNA连接酶连接，完成修补。 重组修复不能完全去除损伤，损伤的DNA段落仍然保留在亲代DNA链上，只是重组修复后合成的DNA分子是不带有损伤的，但经多次复制后，损伤就被“冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。 (四)SOS修复 “SOS”是国际上通用的紧急呼救信号。SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复(error prone repair)，使细胞有较高的突变率。SOS反应广泛存在于原核和真核生物，它是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。 当DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺，再由损伤诱导产生的一整套的特殊DNA聚合酶SOS修复酶类，催化空缺部位DNA的合成，这时补上去的核苷酸几乎是随机的，但仍然保持了DNA双链的完整性，使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高的突变率。 蛋白质组学的概念和研究意义, 2008 浙江大学博士入学考试医学分子生物学试题(甲) 一、名词解释 1、核糖开关:指的是mRNA一些非编码区的序列折叠成一定的构象，这些构象的改变应答于体内的一些代谢分子，从而通过这些构象的改变达到调节mRNA转录的目的。 2、反式作用因子:是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。 3、质粒:质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。 4、锌指结构:一种常出现在DNA结合蛋白中的一种结构基元。是由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn2+构成，形成的结构像手指状。 5、分子杂交:是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的分子所处的位置的过程. 6、hnRNA :hnRNA是heterogeneous nuclear之缩写，为存在于真核生物细胞核中的不稳定、大小不均的一组高分子RNA，大部分的hnRNA在核内与各种特异的蛋白质形成复合体而存在着。认为hnRNA多属信使RNA之前体，包括各种基因的转录产物及其成为mRNA前的各中间阶段的分子。 7、cDNA :cDNA指与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由RNA与DNA进行一定条件下合成的DNA。 8、密码的简并性:由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并(degeneracy)，对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子。 9、信号肽:是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度5-30个氨基酸)肽链。常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定在N端)。 二、简答题(30 分): 1、什么是乳糖操纵子，简述乳糖操纵子的正负调节机制, 2、简述原核和真核细胞在核酸翻译成蛋白质的过程中的异同点,(参考其它版 本) 氨基酸的活化 原核生物中，起始氨基酸是:甲酰甲硫氨酸 起始AA-tRNA是:fMet-tRNAfMet。真核生物中，起始氨基酸是:甲硫氨酸 起始AA-tRNA是:Met-tRNAMet 真核生物翻译起始复合物形成(区别原核生物)原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80S?mRNA?Met-tRNAMet起始复合物 3、质粒的不相容性和相容性指的是什么,其分子基础机制是什么, 同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性。当一种新的质粒进入已经含有质粒的细胞中时，若两种质粒同源或近缘，它们就会竞争资源，而竞争的结果就是一个胜利另一个则被消除。但此过程需要几代或几十代或更长的细菌繁殖周期，而并不是一个快速的过程。质粒被分为两大组，同组中的质粒会相互竞争排斥。 或利用同一复制系统的不同质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种。此外，整合到寄主染色体中的质粒和自主性质粒之间也具有不相容性，例如在大肠杆菌的Hfr菌株细胞中，自主性质粒F因子就不能稳定地保持。 不相容现象的机制尚可能是在质粒DNA复制的某个阶段起相互排斥的作用。这种现象是质粒分类的主要指标。 版本二: 质粒的不相容性及其分子机理。 ? 定义:任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。 ? 分子机理:两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制同时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 4、核酸凝胶电泳的基本原理和方法是什么, 生物大分子在一定pH条件下，通常带电荷，将其置于电场中，会以一定的速度向与其电荷性质相反的电极迁移，迁移速度称电泳速率。电泳速率与电场强度、分子所带的净电荷数成正比，与分子与介质的摩擦系数成反比。摩擦系数与分子的大小、构型及介质的粘度有关。在生理条件下，DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态，故DNA实际上呈多聚阴离子状态，在电场中向正极方向迁移。糖-磷酸骨架在结构上重复，故等量的双链DNA几乎带等量的净电荷。如电场强度一定、电泳介质相同，电泳速率就取决于核酸分子的大小和构型。 构型相似的分子:分子量越大、迁移越慢。分子量相同的分子(如质粒):cccDNA迁移最快、L-DNA次之、ocDNA最慢。 核酸凝胶电泳的方法有琼脂糖(agarose),聚丙烯酰胺(polyarylamide)凝胶电泳。 5 谈谈你的硕士论文的基本内容，研究方法和结果，有什么收获，打算你的博士生涯如何度过, 三、问答题(40 分): 1、简述3 种由PCR 技术衍生出来的技术及其应用, 几种重要的PCR衍生技术 (一)逆转录PCR技术 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 (二)原位PCR技术 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。 (三)实时PCR技术 实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 2、试述一条反向遗传克隆功能基因的途径。 传统的遗传学手段大致可以分为“正向遗传学”(forward genetics)和“反向遗传学”(reverse genetics)两类.正向遗传学是指,通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变,寻找相关的表型或性状改变,然后从这些特定性状 变化的个体或细胞中找到对应的突变基因,并揭示其功能.例如遗传病基因的克隆.反向遗传学的原理正好相反,人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质,然后再去寻找有关的表型变化.例如基因剔除技术或转基因研究.简单地说,正向遗传学是从表型变化研究基因变化,反向遗传学则是从基因变化研究表型变化. 反向遗传学是相对于经典遗传学而言的.反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容.反向遗传克隆功能基因的途径如RNAi. RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下,可形成-22 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNAs,siRNAs),siRNAs可进一步掺入多组分核酸酶并使其激活,从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA,完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达. 3、近年来有些什么分子生物学研究的成果应用到实际应用当中, 4、阐述一种细胞信号转导的途径(从接受信号到调控基因表达)。 5、给你一个cDNA 序列,你如何表达,纯化得到所需要的目的蛋白质, 2007 浙江大学博士入学考试医学分子生物学试题(甲) 一、名词解释 1、结构域:是生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，特别指蛋白质中这样的区域。在球形蛋白中，结构域具有自己特定的四级结构,其功能部依赖于蛋白质分子中的其余部分，但是同一种蛋白质中不同结构域间常可通过不具二级结构的短序列连接起来。蛋白质分子中不同的结构域常由基因的不同外显子所编码。 2、EMSA:电泳迁移率变动实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)，它是根据裸露的DNA与结合有某种蛋白的相同大小的DNA在电泳中具有不同的迁移率这一原理(DNA-protein复合物由于具有较高的分子量，因此通过凝胶的速度要比裸露的DNA缓慢)，在20世纪80年代初期设计出来的用于检测与特定DNA片段相结合的特定蛋白的一种实验技术。目前也可用于RNA结合protein的研究。 3、转座子:转座因子或转座子是一类在很多生动物中(包括线虫、昆虫和人) 发现的可移动的遗传因子。 一段DNA顺序可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称转座。这段序列称跳跃基因或转座子。 a segment of DNA that can become integrated at many different sites along a chromosome (especially a segment of bacterial DNA that can be translocated as a whole) 二、简答题: 1、何谓乳糖操纵子，以乳酸操纵子为例说明基因表达与阻遏, 2、核酸凝胶电泳的基本原理和方法是什么, (同前) 3、简述原核和真核细胞在核酸翻译成蛋白质的过程中的异同点,(同前) 4、DNA 克隆的筛选方法及原理。 重组克隆的筛选与鉴定:转化子与非转化子，重组子与非重组子。阳性克隆筛选: 平板筛选:(1)插入失活法;(2)插入表达法(β—半乳糖苷酶显色反应)。电泳筛选;核酸分子杂交筛选法:(1)原位杂交(in situ hybridization)，(2)Southern杂交，(3)Northern杂交。核酸序列测定法。 (1)根据抗药性标志筛选:对于带有某种抗药性标志基因，只有转化成功的受体菌才可能在含该抗生素的培养基中生存并形成菌落;而没有转化成功的受体菌，不能在培养基中生长，以此可选择阳性菌。(2)根据菌落的呈色反应筛选(互补、蓝-白筛选):根椐菌落的颜色并结合插入片段的序列测定筛选。(3)营养缺陷型标记法:(4)核酸分子杂交法:即采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，以确定重组体中带目的基因。包括原位杂交和southern印迹杂交。(5)遗传互补法:载体上的营养代谢标记可以对宿主细胞的营养代谢缺陷进行互补，以此作为筛选重组体的标记。(6)免疫学方法:如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可以用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。 5、何谓质粒的不相容性和相容性,其分子基础机制是什么, 同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性。当一种新的质粒进入已经含有质粒的细胞中时，若两种质粒同源或近缘，它们就会竞争资源，而竞争的结果就是一个胜利另一个则被消除。但 此过程需要几代或几十代或更长的细菌繁殖周期，而并不是一个快速的过程。质粒被分为两大组，同组中的质粒会相互竞争排斥。 利用同一复制系统的不同质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种。不相容现象的机制尚可能是在质粒DNA复制的某个阶段起相互排斥的作用。这种现象是质粒分类的主要指标。此外，整合到寄主染色体中的质粒和自主性质粒之间也具有不相容性，例如在大肠杆菌的Hfr菌株细胞中，自主性质粒F因子就不能稳定地保持。 6、三、问答题: 1、试述一条反向遗传克隆功能基因的途径。(同前) 2、假定事先给你一个cDNA 序列，你如何表达、纯化得到目的蛋白质, 3、阐述一种细胞信号转导的途径(从接受信号到调控基因表达)(同前) 4、ELISA 方法的基本原理，方法，及其种类, ELISA的基本原理有三条:(1)抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性;(2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性;(3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面: 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。 方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1,10μg,ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4?过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37?孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3. 加酶标抗体:于各反应孔中，加入新鲜稀释的 酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37?孵育0.5,1小时，洗涤。 4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37?10,30分钟。5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6. 结果判定:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O?D值:在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O?D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 方法二 用于检测未知抗体的间接法:用包被缓冲液将已知抗原稀释至1,10μg,ml， 每孔加0.1ml，4?过夜。次日洗涤3次。 加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37?孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37?孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。 5、原核生物和真核生物基因结构的差别有哪些,怎样去用实验证明呢, 2006 浙江大学博士入学考试医学分子生物学试题及答案 一、名词解释:(25%) 、RFLP:限制性片段长度多态性，是由DNA 变异(产生新的酶切位点或消除原1 有的酶切位点)导致在限制性核酸内切酶酶切时产生不同的长度片段。可借助Southern Blotting 或PCR 的方法进行检测。 2、SSR:简单序列重复多态性，引物是根据微卫星DNA 重复序列两翼的特定短序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大，所以是检测多态性的一种有效方法。其特点包括:一般检测到的是一个单一的多等位基因位点，共显性遗传，故可鉴别杂合子与纯合子;得到的结果重复性很高。 3、EST:表达序列标签，是指从不同的组织构建的cDNA 文库中，随机挑选不同的克隆，进行克隆的部分测序所产生的cDNA 序列。随着高通量测序技术的进步，使人们越来越相信，大规模地产生EST，结合生物信息学的手段，将为人们提供一种快速有效的发现新基因的方法。 EST(expressed sequence tag，EST)表达序列标签:短的、单次(测序)阅读的cDNA5’或3‘端序列。也包括来自于差异显示和RACE实验的cDNA序列。 一般是来自不同组织来源的cDNA序列，长度在300-500bp左右。 4、STS:序列标签位点，是由特定引物序列所界定的一类标记的统称，短的在基因组上是可以被唯一操作的序列，因而可以确定在物理图谱上的特定位置。 5、CAP:CAP 即分解代谢物基因活化蛋白，是一种激活蛋白，因为细菌的许多启动子为弱启动子，本身与RNA 聚合酶的作用较弱，在有CAP 蛋白这类激活蛋白存在下，可使RNA 聚合酶与启动子的亲和力增强，CAP 蛋白的活性强烈依赖cAMP。 6、AFLP:扩增片段长度多态性，其特点是把RFLP 和PCR 结合了起来。其基本步骤是:把DNA 进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR 扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”， 用与接头互补的3’—端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR 扩增，只有那些与3’—端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 7、SNP:单核苷酸多态性，是一种较为新型的分子标记，其依据的是一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，因此在分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测是很有意义的。 、FISH:荧光原位杂交技术，是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本8 进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性，荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来，通过荧光标记的DNA 探针与待测样本的DNA 进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。 9、Genome:基因组，有机体或细胞中的所有DNA，包括核中的染色体和线粒体中的DNA。 10、RNA in situ hybridization:RNA 原位杂交，是利用cDNA 为探针来检测与其互补的mRNA 链在细菌或其他真核细胞中的位置，是检测基因组织特性表达的常用方法。 11、单克隆抗体:每个B 淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B 淋巴细胞系，含遗传基因不同的B 淋巴细胞合成不同的抗体。 当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B 细胞。被激活的B 细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B 细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 12、基因芯片:所谓基因芯片，是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的DNA 分子或RNA 分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交，技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等不足，而且，通过设计不同的探针阵列，用一定的分析方法，还可以用于序列分析，称作杂交测序。 二、描述 cDNA 文库构建原理与方法 (1)cDNA 获得方法，(2)克隆方法，(3)文库质量定义。 答: cDNA:以mRNA 为模板，利用反转录酶合成与mRNA 互补的 DNA(complementary DNA，cDNA)，再复制成双链cDNA 片段，与适当载体连接后转入受菌体，扩增为cDNA 文库(cDNA library)，然后再采用适当方法从cDNA 文库中筛选出目的cDNA。与基因组DNA 文库类似，由总mRNA 制作的cDNA 文库包括了细胞全部mRNA 信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。 (1) cDNA获得方法:?Total RNA的提取;?mRNA的分离;?cDNA双链合成:Superscript II—RT合成第一链，cDNA 第二链的合成，双链cDNA 末端补平，EcoR I adaptor 加接，双链cDNA 末端的磷酸化及Xho I 酶切，胶回收cDNA。 (2)克隆方法:?载体制备:p Blue Script II 的提取，p Blue Script II 的双酶切消化，载体去磷酸化，载体效率检测;?cDNA双链和载体的连接:连接，检测(PCR 方法);?电转化:电转化感受态细胞的制备，连接产物纯化，电转化;?快速鉴定、菌落 PCR ?p Blue Script cDNA文库扩增。(3)文库质量定义:评价一个文库是否有实用价值主要在于文库的含量和插入片段的大小两个方面。所构建的文库中必须有足够多的克隆数，这样才能确保基因组cDNA 中的每一个序列至少有一个拷贝存在于重组文库中，为达到这一要求, 文库的容量应 不小于1.7×105 ，同时为保证cDNA 片段的完整性，插入片段的平均大小应不小于1kb。 三、阐述基因突变的概念及引起突变的可能途径(25%):(1)化学诱变，(2)物理诱变，(3)T-DNA 插入，(4)缺失、插入，(5)无义突变概念，(6)碱基修复概念基因突变的特点。 答:基因突变属分子水平上的变异，是指染色体上个别基因所发生的分子结构的变化，基因突变在自然界普遍存在。基因突变的方式很多，主要有:(1)化学诱变，基因突变可以由某些化学物质所引起，这些化学物质称为化学诱变剂。现已知很多的化学诱变剂，它们诱变的机制是不同的。在DNA 复制过程由于碱基类似物的取代，碱基的化学修饰以及碱基的插入和缺失都会引起突变。(2)物理诱变，利用物理因素引起基因突变的称物理诱变，如X 射线、紫外线、电离辐射等。(3)T-DNA 插入，改变读码或变成假基因。(4)移码突变:基因中插入或者缺失一个或几个碱基对，会使DNA 的阅读框架(读码框)发生改变，导致插入或缺失部位之后的所有密码子都跟着发生变化，结果产生一种异常的多肽链。移码突变诱发的原因是一些像吖啶类染料分子能插入DNA 分子，使DNA 复制时发生差错，导致移码突变。(5)无义突变，由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变。(6)碱基修复:DNA 损伤的修复系统主要有以下几个:?损伤碱基的直接修复;?切除修复，包括碱基切除修复、核苷酸切除修复和DNA 交链的切除修复;?错配修复;?重组修复，又称复制后修复;?跨损伤DNA 合成，这是一种利用损伤核苷酸为模板，通过DNA 聚合酶I 使碱基掺入到复制终止处进行DNA 合成，从而延长DNA 链的修复。 基因突变的特点为: 第一，基因突变在生物界中是普遍存在的; 第二，基因突变是随机发生的; 第三，在自然状态下，对一种生物来说，基因突变的概率是很低的; 第四，大多数基因突变对生物体是有害的，由于任何一种生物都是长期进化过程的产物，它们与环境条件已经取得了高度的协调; 第五，基因突变是不定向的。 四、阐述一条反向遗传克隆功能基因的途径(25%) 答:反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。 比较典型的反向遗传克隆功能基因的途径，如 RNAi。RNAi 的机制可能是细胞内双链RNA 在Dicer 酶的作用下，可形成-22 bp 大小的小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs 可进一步掺入多组分核酸酶并使其激活，从而精确降解与siRNAs 序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达(下略)。 浙江大学 2005 春博士 分子生物学(甲) 一、名词解释(20%)(同上) RFLP 、SSR 、 EST 、STS 、CAP 、 FISH 、AFLP 、SNP 、genome 、mRNA in situ hybrization。 二 问答题 1、阐述PCR 的原理和方法(15,)(同上) 2、阐述cDNA 文库原理和构建方法(20,)(同上) 3、阐述一种细胞信号转导的途径(从接受信号到调控基因表达)(25,)(同上) 4、什么是基因突变,并说明产生基因突变有哪些途径(20,)(同上) 浙江大学 2005 秋博士 分子生物学(甲) 回答问题(100,) 1、PCR 技术及其原理。 PCR原理:变性温度下， DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。 影响PCR扩增的影响因素: ?(1)Taq酶:常用1U/25µL ?浓度低，扩增产物不够;?浓度高，非特异性扩增增加; ?酶的活性;?(2)dNTP的浓度:常用100-200µmol/L，不能低于20µmol/L，特异性、保真性;?(3)模板:主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng.?(4)引物浓度:0.1-0.5µmol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体;?(5)Mg2 浓度:常用 0.5-2.5mmol/L; 影响:酶的活性、引物-模板退火、特异性?(6)PCR反应程序设定:变性温度和时间、引物退火温度Tm与时间、引物延伸温度与时间和循环数 2、激素的作用机制及其调控。 3、基因芯片的原理和应用。 4、cDNA 文库的构建。(同上) 5、试述一条反向遗传克隆功能基因的途径。(同上) 完成于2015.2.21 iesvev