DNA的提取与保存方法

DNA的提取与保存方法 1(-20度冻存1年是没有问题的，当然越低越好。但是冻存后，用蛋白酶K法，红细胞不易裂解，必须采用特殊方法裂解。 2(建议裂解红细胞后再冻存于,80度。因为冻融后红细胞会裂解，而且红细胞会增加蛋白污染，影响DNA抽提 3(我们实验室加ACD抗凝血液，保存3年了，抽提DNA没问题(我们是先离心后分层保存，以便后续试验)～ 血DNA提取技术 分离外周血白细胞提取方法: 试验步骤: 1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4、2500rpm离心10min，弃上清。 5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。 6、3000rpm离心10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，,80?C冻存。 试验要求: 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4?放置不超过5h，以防白细胞自溶。 氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA: 试验试剂: Ligsisbuffer: 133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml;最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。 ACD抗凝剂:柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g;最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。 提取缓冲液(Extractionbuffer): 10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0 .5%SDS10%SDS0.5ml;最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌 试验步骤: 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl(裂解细胞)，混匀置于37?，水溶1h。 4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37?过夜(或55?，3h，但是37?效果要好些)。 5、每管加入450μl饱和酚(取溶液下层)缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。 6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿,异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7、取上清，每管加入500μl氯仿,异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC，，适量无水乙醇(预冷)至满，摇匀放入-20?保存2h以上。 9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70,乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50,60?干燥。 10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。 NaI提取法提取外周血白细胞基因组: 实验步骤: 1、取外周抗凝血(全血)100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。 2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇(24:1)400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。 5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。 6、弃异丙醇，加70,乙醇1ml(不振动)，以15000rpm离心12min。 7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干(37?恒温箱)后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA,12h以上，制成的DNA液-20?冰箱保存备用。 从外周血提取DNA是一个经常遇到的问题，当然可以用试剂盒提取，不过代价还是有点大，并且不方便，定试剂总要等上几天，如果血液标本不稀缺资源，不妨用一些简便方法提取。 方法一 (1) 取抗凝血5ml在沉淀中加入15ml PBS，混匀，离心2000r/min10min。 (2) 将血浆转至新的试管中，-70?保存。 (3) 将血细胞转入另一支试管中(10ml或50ml)加入尽可能多的冷的蒸馏水混匀。 (4) 将其插入冰内5,10min或放入-20?15min。 (5) 将上述混合液从冰中或-20?取出放至室温，离心2000r/min20min。 弃上清，收集沉淀。 (7) 在沉淀中加入15ml PBS，混匀，离心2000r/min10min。 此步骤重复3次至沉淀为淡红色或白色。 将沉淀转入小管，加少量PBS，每分钟5000r/min离心5min，去上清。 (9)沉淀-70?保存。 常用的外周血白细胞基因提取方法: 试验原理: 苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。 试验步骤: 1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)，混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37?水浴温育1h。 2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37?水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50?水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。 3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。 4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20?冰箱保存备用。 真核细胞DNA的制备 一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则: 1、防止和抑制DNase对DNA的降解。 2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 试剂准备: 1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。 2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。 3、裂解缓冲液:250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。 4、20%SDS 5、2mg/ml蛋白酶K 6、Tris饱和酚(pH8.0)、酚/氯仿(酚?氯仿=1?1)、氯仿 7、无水乙醇、75%乙醇 试验步骤: 材料处理: 1、新鲜或冰冻组织处理: 1)取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。 3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。 4)60?C水浴1-3hr。 2、培养细胞处理: 1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。 2)离心4000g×5min，去除上清液。 3)加10倍体积的裂解缓冲液。 4)50-55?C水浴1-2hr。 DNA提取: 1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。 2、离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。 3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。 4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不 澄清，可重复此步骤数次。 5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。 6、加1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。 7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。 8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。 9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。 、 全血的采集保存和DNA的提取 I. 用 含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有EDTA和肝素，EDTA更好一些，不会影响下游的反应，如果没有采血管，也可以自己添加抗凝剂EDTA，提前准 备0.04M的EDTA溶液，每5ml的血液中加入0.4ml配好的EDTA溶液，颠倒混匀即可。保存于-20?至-80?，一般2-3年内均可以提取，保存时间越短，提取的质量越高，最好在2个月内提取。 II. DNA提取方法的选择:全血提取试剂盒一般有离心柱和溶液型两种(比如Qiagen、 Promega、Bioteke;摒弃酚氯仿手提的方法，时间长毒性大)，原理及步骤基本相同。虽然各公司推出了N多型号，让人不知如何去选择，但从原理 和操作步骤看，基本就是离心柱和溶液型两种。一般来说，离心柱(DP1801)的提取纯度高一些，但是处理量小(0.1-1ml)、得率略低;溶液型 (DP2101或DP2201)的提取量大(1-10ml)得率也高于离心柱。医院的血液标本一般在2ml以上，一般选择溶液型的方法提取.在说到国产和 进口差别的时候，很多人以为进口一定比国产的好，我们觉得没有最好，只有更好～在不断的进行试验优化之后，全血基因组DNA提取试剂盒DP2101或 DP2201开创了第三代技术，不需要蛋白酶K消化，进口的都是要借助蛋白酶K的啊～DP2101或DP2201减少了蛋白酶K现配现用的麻烦和消化的时 间，而且提取量和稳定性更好。 III. 非抗凝血(凝固血)能否提取, 答案 八年级地理上册填图题岩土工程勘察试题省略号的作用及举例应急救援安全知识车间5s试题及答案 是肯定的，而且一点都不麻烦，提取效果和抗凝血没有差别～在你找遍了进口的所有品牌都找不到后，回过头来您才发现原来他就在身边，百泰克的凝固血基因组DNA提取试剂盒已经有很多忠实的用户。 下在是网上找的一般保存DNA的方法 DNA在如下情况下稳定: (1)中性pH， (2)低温，可以储存于-20度冰箱， (3)暗处(避免紫外线)， (4)合适的盐浓度(比如100mmol/LNaCl)， (5)无物理剪切。 在DNA操作中应该降低DNase对于DNA的降解，大部分DNase降解DNA时要有二价阳离子(如Mg2+，Ca2+)，可以加入EDTA进DNA溶液。还有要避免来自细菌和土壤溶液的污染物，其中很可能有DNase。 有三种缓冲溶液可用于溶解或保存DNA: (1)TE[T10E1:10mmol/L Tris.HCl(pH=8.0),1mmol/LEDTA(pH=8.0)]; (2)0.1*TE(用于酶促反应); (3)T50E[T50E:50mmol/L Tris.HCl(pH=8.0),1mmol/LEDTA(pH=8.0)。用于溶解 pH不稳定的DNA]。 降解的问题跑胶就很容易判断了，保存的TE或者ddH2O都要灭菌的，不然冻 -20还是容易降解。