G418筛选程序G418筛选程序
一、 杀伤曲线
41. 在24 孔板内接种细胞，约3x10/孔(只是参考值，根据细胞的体积和生长速度调整)，共11孔，培养过夜。
2. 第二天，观察细胞密度为20%-30%(如果密度不合格，请重新进行细胞接种，不要勉强进行，浪费时间)。稀释G418 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800,
900, 1000 µg/ml，如果G418储液浓度较高，进行稀释时，所取体积很小，有困难，请先把储液进行稀释(需要多少，稀释多少)，以稀释的储液在进行稀释...
G418筛选程序
一、 杀伤曲线
41. 在24 孔板内接种细胞，约3x10/孔(只是参考值，根据细胞的体积和生长速度调整)，共11孔，培养过夜。
2. 第二天，观察细胞密度为20%-30%(如果密度不合格，请重新进行细胞接种，不要勉强进行，浪费时间)。稀释G418 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800,
900, 1000 µg/ml，如果G418储液浓度较高，进行稀释时，所取体积很小，有困难，请先把储液进行稀释(需要多少，稀释多少)，以稀释的储液在进行稀释)至培养基, 每孔加入0.75ml培养基。
3. 每隔2天观察细胞的存活情况(贴壁细胞飘起即为死亡，悬浮细胞，可以通过观察细胞的膜情况来判断，死亡细胞的细胞膜较为粗糙，有皱褶，没光泽，准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准)，每隔3-4天更换0.75ml含相应浓度G418的培养基。
4. 筛选5-10天(早也不行，晚也不行)内使细胞全部死亡的最低G418浓度，即为杀伤浓度(筛选浓度);
二、 细胞筛选
1. 转染(24孔板进行)或电转后培养24小时，按10%密度传代(传至35mm
平皿)，继续培养24小时，待细胞密度增至20,,25,汇合时; 2. 去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度(杀伤曲线实验确定)配制
好的G418筛选培养基2-3ml。
3. 根据培养基的颜色和细胞的存活情况，每隔3-4天更换一次筛选培养基 (培
养基用量为2-4ml，细胞多，多加培养基，细胞少，少加培养基), 一般在5-6
天内出现细胞大量或少量死亡情况(如果转染效率或电转效率高，则死亡少;
如果转染效率或电转效率低，则死亡多;如果筛选浓度偏低，筛选培养基用
量少，细胞密度大于80%，会导致大量假阳性克隆)。如果筛选第一周，出
现细胞大量死亡，则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周;如果
筛选第一周，出现细胞少量死亡，则把细胞按10%密度传代(传至35mm平
皿，传一个皿即可，多余细胞丢弃)，利用筛选培养基进行筛选一周; 4. 筛选第二周结束后，则把细胞消化下来，进行终点稀释(10ul培养基中含1
个细胞，用筛选培养基稀释)，把上述10ul细胞悬液加入96孔板中(提前加
入40ul筛选培养基)，一共加24孔，4小时后观察每个孔的情况，记录只含
一个细胞的孔，含有一个细胞的孔用于继续筛选，其余孔舍弃; 5. 根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基，待细胞密度为80%
时，将其传代至24孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至6孔板中
增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至T25瓶(一传3)中增殖，每隔3
天换液。
6. 细胞大量扩增后，一瓶用于提取总RNA进行QPCR检测，一瓶用于总蛋白
进行WB检测，另一瓶用于保种，根据QPCR和WB结果取舍阳性克隆; 注意事项:
1、筛选时细胞密度必须均匀并为20-25%;
2、G418筛选浓度在整个过程中不可改变;
3、G418筛选剂量(G418筛选浓度*培养基用量)必须根据细胞密度调整;
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