Trizol试剂提取DNA的实验方法
操作步骤:
?用Trizol试剂匀浆细胞和组织的方法同RNA提取步骤。
?在细胞匀浆中加入氯仿，每1ml Trizol的起始用量加入0.2ml氯仿。剧烈震荡30秒钟后室温放置2~3分钟。
?4?下10,000g离心10分钟。
?小心吸取并丢弃上层水相(该水相中富含细胞总RNA，如果需要提取RNA，则收集该水相)。如果水相清除不彻底，将可导致提取的DNA中混杂有RNA。
?在剩下的中间层及有机相中加入无水乙醇，每1ml 起始Trizol用量加入0.3ml无水乙醇。颠倒充分混匀后室温放置2~3分钟。
?4?下2,000g离心5分钟。
?小心吸取并丢弃上层的酚醇有机相，沉淀即为DNA。将DNA沉淀用清洗液(0.1M柠檬酸钠，10%乙醇)清洗2次。每1ml 起始Trizol用量的沉淀DNA加入1ml清洗液，在每次清洗过程中，DNA沉淀保存于室温清洗液中30分钟，期间震荡数次，然后4?下2,000g离心5分钟。弃去上层液相。 ?注:如果DNA沉淀量较多。大于200,g，或含有较多量的非DNA物质，可
以用上述清洗液多清洗几次。
?数次清洗后，DNA沉淀用75%乙醇悬浮，每1ml 起始Trizol用量的DNA沉淀用1.5~2ml 75%乙醇悬浮，在室温下放置10~20分钟，期间震荡数次，然后4?下2,000g离心5分钟。弃去上层液相。
?打开管盖，空气干燥DNA沉淀5~15分钟，加入适当体积的8mM NaOH溶液悬浮DNA沉淀(该方法提取的DNA难以溶于蒸馏水或Tris-Cl缓冲液中，故推荐采用8mM NaOH溶解DNA。该浓度的NaOH溶液pH约为9，DNA溶解后，容易用TE缓冲液或者HEPES调校pH)。8mM NaOH 的DNA悬浮液中可能含有不溶性的凝胶状物质(如细胞膜碎片等)。以,12,000g的速度离心10分钟去除不溶物，上清液转移到一支新的收集管中。溶解于8mM NaOH的DNA可在4?下存放过夜。如果需要延长保存时间，需要用HEPES将溶液的pH调校至7~8，并在溶液中加入EDTA至终浓度为1mM。pH调校好的DNA溶液可存放于4?或-20?。
, DNA溶液的应用:
?PCR扩增DNA
DNA溶解于8mM NaOH后，用0.1mM HEPES调校pH至8.4(参考下
表
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调校)。在PCR反应体系中加入0.1,g~1,g DNA作为
模板
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，按标准程序完成PCR。
?限制性核酸内切酶反应
DNA溶解于8mM NaOH后，用HEPES调校至适当pH(参考下表调校)。或者DNA用pH 7~8的1mM EDTA溶液透析。酶切反应体系中，每1 ,g DNA加入3~5 U酶，缓冲液采用酶供应商推荐的特定配方，酶切3~24小时。一般来说，80%~90%的DNA都可被限制性核酸内切酶切割。
, 溶于8mM NaOH 的DNA溶液pH调校方法:
1ml含8mM NaOH 的DNA溶液加入以下体积的0.1M HEPES或1M HEPES(free acid)
目标pH 0.1M HEPES用量(,l) 目标pH 1M HEPES用量(,l) 8.4 7.2 23 ,,
8.2 93 7.0 32 8.0 101 7.8 117 7.5 159
浙公网安备 33021202002483