第十章 动物基因工程

第十一章　动物基因工程基因工程的概念：利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.基因工程(geneengineering)常和以下名称混用遗传工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.作动词时是指基因的分离与重组过程。第一节　基因工程的发展历程1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼1993基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊耐农药/抗虫能力(第一代)Bt抗虫玉米传统玉米簡介4(InputTraits)Source:Monsanto黃金米可以防治维生素A缺乏症成为健康食品改变营养组成(第二代)5(OutputTraits)世界转基因作物大田释放情况(1987.1-1998.4)转基因作物特性批准项数所占比例抗除草剂129729.6%抗虫104623.8%提高产品质量88620.2%抗病毒4369.9%改善农学性状2114.8%抗真菌病2084.7%其他3036.9%总计4387100%转基因作物种植面积将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!胰岛素生产车间带有人生长激素基因的转基因小鼠正常小鼠1982年:“超级鼠”干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。干扰素生产车间干扰素分子结构基因工程人干扰素α-2b（安达芬）是我国第一个全国产化基因工程人干扰素α-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人造血液及其生产转基因鱼生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国)转基因牛乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯不会引起过敏的转基因大豆Fourteenmonth-oldgeneticallyengineered(“biotech”)salmon(left)andnon-engineersalmon(right).世界上第一個….基因改造蕃茄1994年美國加州FlavrSavrTomato,CalgenePhotobyJackDykinga.SourcesARSPhotoUnit,2001,USDA.3SometimesBiotechnologyInvolvestheManipulationofNaturalBiologicalProcessesWithoutModifyingGenesDolly(left)wasaclonecreatedwithouttheneedforanygeneticmodifications.DollyandsurrogateMomTheBiotechnologyofReproductiveCloning(Science(2002)295:1443)CopyCat–theFirstClonedPetSoulMates–FiveGeneticallyIdenticalPigletsUSU’sContribution–AClonedMule基因工程试剂的高回报碱性成纤维细胞生长因子231元/ug红细胞生成素1072元/ug白细胞介素-2410元/ug巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元/ug胰岛素10.2元/mg第二节　基因工程的一般原理一、常用的工具酶限制性核酸内切酶（Ⅱ类）切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基二、基因工程的基本程序一.分—载体和目的基因的分离二.切—限制性内切酶的应用三.接—载体与目的基因连接成重组体四.转—基因序列转入细胞五.筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定基因克隆示意图一.分—载体和目的基因的分离（一）载体1.质粒（plasmid)2.噬菌体（phage)3.动物病毒载体（virus)质粒—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子理想的质粒1.拷贝数多;2.两三个抗药性基因terrampr筛选标志3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）（二）.目的基因的来源和分离1.PCR2.基因组文库3.cDNA文库4.人工化学合成二.切—限制性内切酶的应用1.限制性内切酶概念简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子中特定碱基序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。限制酶从原核生物中提取，现已发现了600多种。2.命名例：EcoRI，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶EcoRI序号属名种名株名3.作用限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是对DNA分子进行操作的手术刀。Ⅱ型限制性内切酶的基本特征⑴在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割，使DNA双链断裂；⑵识别序列一般为4~7个碱基对，这些碱基顺序大都是沿中心轴回转180°可以重合，也称回文序列。⑶能产生两种切割方式：错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端三.接—载体与目的基因连接成重组体1.粘性末端连接2.平端连接常用的DNA限制性内切酶的专一性酶辨认的序列和切口说明‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口四.转—基因序列转入细胞　1.转化　以质粒作为载体构建的重组DNA分子引入受体细胞的过程　2.转染　以噬菌体或或病毒为载体构建的重组DNA分子引入受体细胞的过程五.筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定　1.按重组载体的标志进行筛选　2.核酸杂交法　3.DNA限制性内切酶图谱分析　4.PCR　5.免疫学方法1.据重组载体的表型进行筛选可以利用载体质粒对抗生素的抗药性进行筛选。如质粒pBR332，由4362个核苷酸对构成对四环素及氨苄青霉素均有耐药性。2.DNA限制酶切图谱分析提取重组DNA经限制性内切酶切割在琼脂糖凝胶电泳比较重组体与原来载体　　　从DNA片段的大小与有无来区别是否已发生重组。3.利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定将菌落DNA转移到硝酸纤维素滤膜上，另外用放射同位素，标记目的基因，制成溶液，作为“探针”将菌落DNA与“探针”一起温育，若菌落含有目的基因，就可把“探针”吸附住把已和探针溶液作用过的滤膜冲洗、烘干，与线底片夹在一起放阴暗处数天，经显影后，有目的基因的所在位置会出现黑点，从黑点位置与菌落DNA比较及鉴定之。克隆基因的表达1.大肠杆菌表达系统2.真核细胞表达系统第三节转基因动物技术一、转基因动物的概念转基因技术是将外源DNA导入细胞的一种技术。它是在DNA重组技术的基础上发展起来的。1981年Gordon和Ruddle首次用显微注射法(Microinjection)把外源基因导入小鼠受精卵的雄核，并将注射后的受精卵植入假孕母鼠子宫，产生了的78只小鼠，其中有2只的所有细胞中(包括生殖细胞)都含有外源基因，但因缺乏启动子而不能表达，他们把出生后带外源基因的小鼠叫做转基因小鼠(TransgenicMice)，自此以后，凡带有外源基因的动物都叫做转基因动物(Transgenicanimal)。二、转基因动物技术的一般步骤(1)选择能有效表达的蛋白质；(2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因；(3)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基因调节序列；(4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细胞或小鼠中预先检验其表达情况；(5)把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中；(6)把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发(7)检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达情况以及外源基因在其后代中的传递情况。三、导入基因的方法导入外源基因的方法有多种，一些方法已在上一节作过叙述，如：①反转录病毒转染法；②磷酸钙沉淀法；③脂质体介导法；④血影细胞(Bloodshadowcell)介导法。在此再介绍一些方法，1）DNA微注射法；2）精子载体法；3)胚胎干细胞（ES）介导法；4)染色体片段注入法；5)电转移法等。在转基因动物中，DNA微注射法比较常用。四、基因的选择与转基因动物的研究现状(一)转入基因的选择(二)转基因动物的研究意义1．提高动物生长、生产性能的研究2．改变奶蛋白成分和性质的设想3．利用家畜产品生产药物蛋白的研究第四节动物克隆技术一、动物克隆的概念所谓克隆(Cloning)就是无性繁殖，动物克隆(Animalcloning)就是不经过受精过程而获得动物新个体的方法。克隆动物(cloninganimal)就是指不经过生殖细胞而直接由体细胞获得新的动物个体。二、克隆动物的一般步骤送入子宫，完成胚胎发育克隆的动物三、克隆动物的意义与前景1．可以用于动物资源的种质保存，可尽可能多地保存地球生物圈内的多样性；2．可以生产移植器官、利用动物作生物反应器生产药物和提供实验动物，造福人类。还可以对人类的某些顽症实施“细胞治疗”。3．可以克隆家畜和濒临灭绝的动物，如大熊猫等。4．利用哺乳动物体细胞克隆技术，可通过建立转基因体细胞系的方式，克隆转基因动物。5．体细胞克隆技术可以直接把优良物种特性传递下去，培育优良物种。