酶活测定方法

二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定一、目的要求了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。二、基本原理多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。三、材料、仪器及试剂（一）材料梨、苹果、马铃薯等。（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000mL）。（三）试剂1．100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。2．提取缓冲液（含1mMPEG、4%PVPP和1%TritonX-100）称取340mgPEG6000（聚乙二醇6000）、4gPVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1mLTritonX-100，用100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100mL。3．50mmol/L邻苯二酚称取275mg邻苯二酚，用50mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50mL。四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。（二）活性测定取一支试管，加入4.0mL50mmol/L、pH5.5的醋酸缓冲液和1.0mL50mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100µL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 反应体系在波长420nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。五、实验结果与计算1．将测定的数据填入下表重复次数样品重量W(g)提取液体积V(mL)吸取样品液体积Vs(mL)420nm吸光度值样品中PPO活性(△OD420·min-1·g-1FW)OD0OD1OD2OD3OD4OD5△OD计算值平均值±标准偏差1232．计算结果记录反应体系在420nm处的吸光度值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD420。然后以每克鲜重（FW）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO活性单位（U），则U=△OD420·min-1·g-1FW。计算公式：式中：△OD420——反应混合液的吸光度变化值；△t——酶促反应时间，min；V——样品提取液总体积，mL；Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；W——样品重量，g。PPO活性还可以每分钟反应体系在波长420nm处吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位（U），表示为U=△OD420·min-1·mg-1蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。六、注意事项应进行预实验，测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化（初级反应）的时间段。这样，只测定某一段时间内反应溶液的初始吸光度值（OD0）和最终值（ODt）这两个数据，就可以计算每分钟吸光度值变化的增加量。七、思考题随着反应时间的延长，多酚氧化酶活性将呈现什么样的变化？（四）超氧化物岐化酶活性测定一、目的要求学习果蔬组织中过超氧化物歧化酶活性的测定原理和方法。二、基本原理超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物与微生物体内。SOD是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD：Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。SOD能够清除超氧自由基（O2-），它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对有机体的毒害。超氧阴离子自由基（O2-）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和O2。H2O2再由CAT进一步催化生成H2O和O2。超氧化物岐化酶催化以下反应：由于超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般利用间接方法测定SOD活性。本实验依据SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下被还原。被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-。当加入NBT后，在光照条件下O2-又可将NBT还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大光吸收。当加入SOD时，SOD可通过清除O2-而抑制了NBT的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。于是，进行光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性愈高。抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。常常将抑制50%的NBT光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U）。三、材料、仪器及试剂（一）材料苹果、梨、番茄等。（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、光照箱（反应试管处日光灯照度为4000LUX）、指形玻璃管、容量瓶（100mL、200mL、1000mL）。（三）试剂1．提取缓冲液：（1）100mmol/L、pH7.8磷酸缓冲液母液A（200mmol/LNa2HPO4溶液）：称取35.61gNa2HPO4·2H2O或53.65gNa2HPO4·7H2O或71.64gNa2HPO4·12H2O，用蒸馏水溶解，定容至1000mL。母液B（200mmol/LNaH2PO4溶液）：称取27.6gNaH2PO4·H2O或31.2gNaH2PO4·2H2O用蒸馏水溶解，定容至1000mL。取91.5mL母液A和8.5mL母液B混合后，调节pH至7.8，然后稀释至200mL，即为100mmol/L、pH7.8磷酸缓冲液。（2）提取缓冲液称取77mgDTT，5gPVP，加入100mmol/L、pH7.8磷酸缓冲液，定容至100mL，摇溶，即得提取缓冲液（含5mmol/LDTT和5%PVP），低温（4℃）贮藏备用。2．50mmol/L、pH7.8磷酸缓冲液3．130mmol/L甲硫氨酸（MET）溶液称取1.94gL-蛋氨酸，用50mmol/L、pH7.8磷酸缓冲液溶解，定容至100mL，充分混匀（现用现配）。低温保存，可使用1~2天。4．750µmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液称取61.3mgNBT，用蒸馏水溶解，定容至100mL，充分混匀（现配现用）。低温避光保存，可用2~3天。5．100µmol/LEDTA-Na2溶液称取37.2mgEDTA-Na2，用蒸馏水溶解，定容至100mL，使用时稀释100倍。低温避光保存可用8~10天。6．20µmol/L核黄素溶液称取75.3mg核黄素，用蒸馏水溶解，定容至100mL，使用时稀释100倍。低温避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，随用随配。四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0g果蔬样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入到离心管中，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液，低温保存备用。（二）活性测定用5支指形玻璃管进行测定。按照表19所列内容加入各种溶液。注意最后加入核黄素溶液。其中3支为测定管，2支为对照管。混匀后将1支对照管置于暗处，其它各管置于4000LUX日光灯下反应15min后，立即取出，置于暗处终止反应。以不照光管做空白参比，于560nm处分别测定其它各管的吸光度值。表19．测定SOD活性各试剂加入量试剂（酶）用量（mL）终浓度（比色时）50mmol/L磷酸缓冲液1.7130mmol/LMET溶液0.313mmol/L750µmol/LNBT溶液0.375µmol/L100µmol/LEDTA-Na2溶液0.310µmol/L20µmol/L核黄素溶液0.32.0µmol/L酶液0.1对照2支管以缓冲液代替总体积3.0五、实验结果与计算1．将测定的数据填入下表重复次数样品重量W(g)提取液体积V(mL)吸取样品液体积Vs(mL)560nm吸光度值样品中SOD活性(U)ODCODS计算值平均值±标准偏差1232．计算结果显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度值（ODS）和照光对照管反应混合液的吸光度值（ODC）。以每分钟每克鲜重（FW）果蔬组织的反应体系对氮蓝四唑（NBT）光化还原的抑制为50%时为一个SOD活性单位（U）表示。式中：ODC——照光对照管反应混合液的吸光度值；ODS——样品管反应混合液的吸光度值；V——样品提取液总体积，mL；Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；t——光照反应时间，min；W——样品重量，g。也可以用以每分钟反应体系对氮蓝四唑（NBT）光化还原的抑制为50%时所需的酶量为一个SOD活性单位（U）。六、注意事项1．需要通过预实验，摸索显色反应所需的时间。2．当测定样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶液和核黄素除外）按比例混合后一次加入2.6mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变，其余各步骤与上相同。4．要求各管受光情况一致，所有反应管应排列在与日光灯管平行的直线上。反应温度控制在25℃左右，视酶活性高低适当调整反应时间。温度较高时，光照时间应缩短；温度较低时，光照时间相应延长。5．所用指形管要洁净透明，透光性好。用浅底广口的小玻璃皿照光效果更好。七、思考题1．在SOD测定中为什么设照光和暗中两个对照管？2．影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？十九、果蔬中过氧化物酶活性的测定一、目的要求了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定果蔬组织中过氧化物酶活性的方法。二、基本原理过氧化物酶（Peroxidase，POD）是果蔬体内普遍存在的一种重要的氧化还原酶，它与果蔬的许多生理过程和生化代谢过程都有密切关系。在果蔬的生长发育、成熟衰老过程、抗病、抗氧化、抗逆境胁迫中，POD活性不断发生变化。在受到外界刺激、病原菌侵染、贮藏环境变化、加工条件改变等作用时，果蔬组织中POD酶活性都会做出相应得应答反应。过氧化物酶催化过氧化氢（H2O2）氧化酚类物质产生醌类化合物。这些化合物进一步缩合或与其它分子缩合形成颜色较深的化合物。在过氧化物酶催化作用下，过氧化氢能将愈创木酚（邻甲氧基苯酚）氧化形成4-邻甲氧基苯酚。该产物呈红棕色，在470nm处有最大光吸收，故可通比色法测定过氧化物酶的活性。三、材料、仪器及试剂（一）材料各种水果和蔬菜。（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、秒表、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL，1000mL）。（三）试剂1．100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。2．50mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液3．提取缓冲液（含1mMPEG、4%PVPP和1%TritonX-100）称取340mgPEG6000（聚乙二醇6000）、4gPVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1mLTritonX-100，用100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100mL。4．25mmol/L愈创木酚溶液取320μL愈创木酚，用50mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液稀释至100mL。5．0.5mol/LH2O2取1.42mL30%H2O2溶液（30%H2O2的摩尔浓度约为17.6mol/L），用50mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液稀释至50mL，现用现配，避光保存。四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。（二）活性测定取一支试管，加入3.0mL25mmol/L愈创木酚溶液和0.5mL酶提取液，再加入200μL0.5mol/LH2O2溶液迅速混合启动反应，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长470nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。五、实验结果与计算1．将测定的数据填入下表重复次数样品重量W(g)提取液体积V(mL)吸取样品液体积Vs(mL)470nm吸光度值样品中POD活性(△OD470·min-1·g-1FW)OD0OD1OD2OD3OD4OD5△OD计算值平均值±标准偏差1232．计算结果记录反应体系在470nm处的吸光度值，制作OD470值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD470。然后，以每克鲜重（FW）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个过氧化物酶活性单位（U），则U=△OD470·min-1·g-1FW。计算公式：式中：△OD470——反应混合液的吸光度变化值；△t——酶促反应时间，min；V——样品提取液总体积，mL；Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；W——样品重量，g。过氧化物酶活性还可以每分钟反应体系在波长470nm处吸光度值读数变化增加1时所需的酶量为1个活性单位（U），表示为U=△OD470·min-1·mg-1蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。即：其中，C表示酶提取液中蛋白质含量（mg/mL）。这里所计算的实际上是酶的比活力，有利于减少操作过程带来的误差。六、注意事项1．应进行预实验。测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化（初级反应）的时间段。这样，只测定某一段时间内反应液的初始吸光度值（OD0）和最终值（ODt）这两个数据，就可以计算每分钟吸光度值的变化量。2．利用100mmol/L、pH6.0磷酸缓冲液作为提取液，可以提取多数果蔬组织中过氧化物酶。配制方法：母液A：0.2mol/LNa2HPO4溶液（53.65gNa2HPO4·7H2O或71.64gNa2HPO4·12H2O配成1000mL）。母液B：0.2mol/LNaH2PO4溶液（27.6gNaH2PO4·H2O或31.2gNaH2PO4·2H2O配成1000mL）。分别取12.3mL母液A与87.7mL母液B充分混匀，调节pH值，稀释至200mL。样品提取液中的其它成分根据需要加入。3．在提取缓冲液中加入PEG，PVPP和TritonX-100等是为了提高酶蛋白的溶解性，减少提取过程中酶活性的损失。这些物质的具体作用可以参阅本书第一篇相关内容。七、思考题1．果蔬组织中POD有哪些方面的作用？2．讨论POD或性测定数据的记录与处理的特点及意义。