酶组织化学应用

酶组织化学的应用姜玉峰石河子大学医学院组胚教研室酶组织化学基本反应原理酶作用底物+相关化学试剂反应产物沉淀↓（有色）酶（孵育液内）（组织细胞内）（镜下观察）显示酶的组织化学方法1.金属沉淀法：磷酸酶的显示甘油磷酸钠磷酸酯+铅磷酸铅硫化铅2.偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法3.电子传递法：氧化酶和脱氢酶的显示酸性磷酸酶底物酶初级反应产物（PRP）重氮盐最终反应产物（FRP）（一）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）又称碱性磷酸单酯酶（EC3.1.3.1）在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解最适PH9.2-9.4激活剂:如Mg++,Mn++,某些氨基酸等抑制剂:氰化物、砷酸盐等（一）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）分布：广泛存在于机体组织，常见于具有活跃转运功能的细胞膜内，如毛细血管及毛细血管动脉部分的内皮细胞，肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘;应用：1.肝脏病、白血病的研究诊断;2.骨的发生和代谢疾病;显示碱性磷酸酶的常用方法:1.钙钴法(Gomori-Takamatsu法)【基本原理】甘油磷酸钠磷酸酯+Ca++磷酸钙磷酸钴硫化钴【孵育液】孵育液的成分：3%β-甘油磷酸钠10ml2%巴比妥钠10ml2%CaCl220ml5%MgSO41ml双蒸水5mlAKP显示碱性磷酸酶的常用方法:1.钙钴法(Gomori-Takamatsu法)【操作步骤】1.新鲜组织低温冰冻切片2.不固定切片直接进作用液,或用1%氯化钙固定5分钟-2小时,4℃,蒸馏水洗3.作用液10-60分钟,37℃4.蒸馏水洗5.2%硝酸钴1分钟6.蒸馏水洗显示碱性磷酸酶的常用方法:1.钙钴法(Gomori-Takamatsu法)【操作步骤】7.1~2%硫化铵1分钟8.蒸馏水洗9.甘油明胶封片,或脱水,透明,中性树胶封片【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法X100肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法X2002.偶氮偶联法⑴Gomori萘酚磷酸酯法AKP在碱性条件下将α-萘基磷酸钠水解出α-萘酚,随后α-萘酚与固蓝B盐在酶活性部位偶联,形成紫红至紫黑色的不溶性沉淀【孵育液】α-萘基磷酸钠,蒸馏水,5%四硼酸钠,10%硫酸镁,固蓝B盐2.偶氮偶联法⑵六偶氮对品红与α-萘酚偶联---以萘酚AS-BI磷酸酯或萘酚AS-TR磷酸酯与六偶氮对品红偶联【孵育液】萘酚AS-BI磷酸钠,二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO),Tris-cl或巴比妥醋酸缓冲液,六偶氮对品红【操作步骤】1.小块组织液氮骤冷,低温冰箱切片2.甲醛钙液(Fca)固定5分钟,4℃,然后蒸馏水洗,也可不固定3.作用液5-60分钟,37℃或室温4.蒸馏水洗5.4%甲醛固定15分钟-2小时,室温6.自来水洗,蒸馏水洗7.1%甲基绿5-10分钟,蒸馏水洗8.甘油明胶封片,或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固【结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀,核呈蓝绿色酸性磷酸酶(ACP)1、反应原理（铅法）：R-O-PO3Na2R-OH+H3PO4(β-甘油磷酸钠)H3PO4+Pb(NO3)2Pb3(PO4)2Pb3(PO4)2+(NH4)2SPbS↓(棕黑色)2、孵育液的成分：0.5mol/L醋酸盐缓冲液（pH5.0）18.5mlβ-甘油磷酸钠45mg2%Pb(NO3)21.5mgACPpH5.0AKP底物：AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐偶联试剂：固兰BB～蓝色固红TR～红色(二)酸性磷酸酶(acidphosphatase,ACP)在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解最适PH为4.8-5.2抑制剂因组织差异而不同:酒石酸,氟化物,0.5%甲醛分布:主要位于溶酶体内应用:前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌(+++)Hodgins淋巴,胃癌,肺癌,乳腺癌等(+++)尤文氏瘤,成骨肉瘤等(-)显示酸性磷酸酶的常用方法1.酸性磷酸酶硝酸铅法【基本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似甘油磷酸钠磷酸酯+铅磷酸铅硫化铅（黑色）【孵育液】硝酸铅,巴比妥-硝酸盐缓冲液，β-甘油磷酸钠【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色ACP显示酸性磷酸酶的常用方法2.同时偶联法【基本原理】ACP在酸性条件下水解萘酚AS-TR磷酸酯为萘酚AS-TR和磷酸,萘酚AS-TR和六偶氮对品红偶联,在酶活性处形成红色的不溶性复合物【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯,六偶氮对品红【操作步骤】1.新鲜组织低温冰箱切片2.不固定或吹干后丙酮固定15分钟3.用孵育液置于37℃水浴箱1~2小时4.流水洗,晾干(1-2分钟)5.用Mayer苏木精或1%甲基绿复染6.流水洗10分钟7.常规脱水透明,中性树胶封片【结果】酸性磷酸酶活性处呈桔红色,胞核兰色(苏木精复染)或绿色(甲基绿复染)涂片-腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶X400(三)5′核苷酸酶(5′nucleotidase)催化核糖核苷和脱氧核糖核苷在C-5′位置水解磷酸酯的水解酶最适PH因组织而异,小鼠肾为7.5,睾丸、脑、肝分别为8.5、7.5-8.5、8.0激活剂：Mg++，Mn++抑制剂：氟化钠（0.1MNaF），硼酸钠OHOHHOHOHHOHH碱基(嘌呤、嘧啶）（H）+H2OPi5′NaseHO-CH2OHHOHHOH（H）H碱基CH2OPHO5′核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶5′核苷酸酶的显示----铅法【基本原理】5′Nase水解底物5′单磷酸腺苷AMP磷酸+铅磷酸铅硫化铅（黑色）【注意】5′核苷酸酶在作用上和碱性磷酸酶相似5′NaseAKP1.肾组织中分布肾小管刷状缘(+),所有仅肾小管刷状缘(+)基膜也(+)2.β-甘油磷酸钠(—)(+)5′Nase作为底物(四)葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G-6-p-酶)肝细胞特有的功能性酶,分解糖原,维持血糖浓度,是糖代谢的关键酶PH6时活性最强,PH8时最稳定,PH5时易变性抑制剂:氟化物,锌和氰离子酒精固定,石蜡包埋后,G6p酶被完全抑制;经甲醛固定而失活硝酸铅法显示G6p酶:葡萄糖-6-p葡萄糖+磷酸磷酸铅硫化铅G6p酶(五)腺苷三磷酸酶又称ATP酶ATPADP+Pi+能量根据所用激活剂、抑制剂以及酶定位的不同，可分为三类ATP酶1.肌球蛋白腺苷三磷酸酶定位于骨骼肌最适PH为9.0-9.4被Ca++激活,而被Mg++抑制常用作区分二型肌纤维:Ⅰ型(红肌)----收缩慢,活动持久,其酶活性高,染色深Ⅱ型(白肌)----收缩快,活动不持久,其酶活性低,染色淡ATPase2.膜性腺苷三磷酸酶又称钠-钾离子激活腺苷三磷酸酶最适PH7.2-7.5激活剂:Mg++,Na+,K+抑制剂:Ca++,苦毒毛旋花子甙常存在于细胞膜,特别是分泌功能活跃的细胞膜。3.线粒体腺苷三磷酸酶心肌最丰富,肝脏次之心肌的线粒体ATP酶被Mg++激活，而被Ca++抑制肝细胞线粒体ATP酶可同时被Mg++、Ca++激活心肌和肝的线粒体ATP酶均可被对-氯汞苯甲酸（PCMB）抑制腺苷三磷酸酶的显示方法1.镁激活的ATP酶法(铅法):在ATP酶活性处,出现棕黑色的硫化铅沉淀。主要用于显示膜性ATPase，也可示线粒体ATPase2.钙激活的ATP酶法(钙钴法):在ATP酶活性处,出现黑色硫化钴沉淀。主要用于显示肌球蛋白ATPase，区分红肌纤维和白肌纤维（六）非特异性酯酶酯酶可分为三类——非特异性酯酶、脂酶、胆碱酯酶非特异性酯酶---水解短链脂肪酸的酯脂酶---水解长链脂肪酸的酯胆碱酯酶---水解胆碱的酯酶非特异性酯酶最适PH5.0-8.0定位在溶酶体和内质网,在肝、肾、胰和小肠具有较高的酶活性应用----单核巨噬细胞、T淋巴、中性粒细胞都有非特异性酯酶反应1.在急性白血病分类诊断时，非特异性酯酶含量多少、有无颗粒及颗粒大小，都有一定的诊断价值2.可作为T、B淋巴细胞的鉴别显示非特异性酯酶法---同时偶联法用乙酸-α-萘酯或萘酚AS衍生物为底物，在酶作用下，释出α-萘酚，与固蓝B或六偶氮对品红偶联，生成紫黑色或红棕色不溶的偶氮染料（七）胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶---神经组织、肌肉、红细胞中胆碱酯酶---血浆中含量丰富显示乙酰胆碱酯酶的方法—Karnovsky-Rotts亚铁氰化铜法【基本原理】碘化乙酰硫化胆碱硫代胆碱+乙酸铁氰化钾亚铁氰化钾亚铁氰化铜沉淀乙酰胆碱酯酶（-SH）Cu++氧化还原酶一类转移电子，催化作用物的氧化还原反应的酶脱氢酶如琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶氧化酶如DOPA氧化酶、细胞色素氧化酶（一）脱氢酶脱氢酶的显示：底物为脱氢酶氧化，从底物释放出氢，经氢传递系统，使受氢体还原而显色常以四唑盐和铁氰化钾作为受氢体组化示脱氢酶分为不需辅酶和必需辅酶二种1.瑚珀酸脱氢酶（SDH）SDH是属于琥珀酸氧化酶系统的酶。不需辅酶的存在SDH存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰富，和线粒体膜牢固结合最适PH7【显示方法】Pearson二甲亚砜法【基本原理】琥珀酸盐+受氢体（四唑盐）富马酸+还原的受氢体（无色）（蓝色沉淀）【作用液】0.1M琥珀酸钠,0.1M磷酸盐缓冲液PH7.6NBT(硝基蓝四唑),二甲亚砜(DMSO)【步骤】1.新鲜组织低温冰冻切片2.作用液15~35分钟3.生理盐水洗4.Fca(氯化钙Formalin)固定10分钟5.入80%乙醇5分钟6.甘油明胶封固或脱水、透明、中性树胶封片【结果】酶活性处为蓝紫色沉淀小鼠心肌冰冻切片-琥珀酸脱氢酶X4002.乳酸脱氢酶（LDH）需辅酶的脱氢酶广泛分布的可溶性酶，为糖原分解的酶系最适PH7.4肝、骨骼肌的酶活性高于心肌【基本原理】催化乳酸和丙酮酸的互变反应乳酸盐+NAD丙酮酸盐+（NADH+H+）LDH（辅酶Ⅰ）（还原型辅酶Ⅰ）（二）过氧化物酶催化各种物质被过氧化氢（H2O2）所氧化见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其前体细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要免疫组化中常用辣根过氧化物酶（HRP）作为大分子示踪剂【显示方法】二氨基联苯胺法示过氧化物酶【基本原理】过氧化物酶作用于底物（3，3-二氨基联苯胺，DAB），催化底物被H2O2氧化，生成棕色的沉淀【作用液】DAB，Tris-cl缓冲液，H2O2【结果】酶活性处呈棕色HRP小鼠腹腔巨噬细胞-过氧化物酶*400白血病涂片-过氧化物酶X400