HIV(ELISA法抗体检测细则1.目的根据《全国艾滋病检测技术
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》（2004年版），对艾滋病病毒抗体检测作必要的细化和补充，以规范本实验室对艾滋病病毒抗体的检测方法。2.适用范围本检测细则适用于对人体血液中艾滋病病毒抗体检测。3.职责3.1检测人员：负责按照本检测细则对被检样品进行检测；3.2复核人员：负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核；3.3科室负责人：负责对科室综合管理和检测
报告
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的签发。4.检测依据GB16000－1995艾滋病诊断标准及处理原则。5.方法原理在微孔板上预包被高纯度基因重组HIV(12)型抗原，可与样品中抗HIV抗体反应，同时加入HRP标记HIV(12)型抗原，然后用TMB底物作用显色，加入终止液终止反应，有颜色变化的微孔板变为黄色，颜色的深浅与血清中HIV抗体含量呈正比，通过酶标仪检测吸光度(OD值)从而判定样品中HIV抗体的存在与否。6.检测仪器设备名称、型号和材料6.1美国宝特ELX800型酶标仪；6.2水浴箱37℃±1℃；6.3(新鲜的)蒸馏水或去离子水；6.4容量器(用于准备洗涤液)；6.5一次性隔离衣、手套、帽子、鞋套。6.6计时器；6.784消毒液、75%乙醇；6.8适用于盛装有可能受污染的物品的容器；6.9吸水纸；6.10微板振荡器（用于溶解及混匀结合物与样品，速度约为900r/min）；第1页共7页6.11KHBST-36W洗板机；6.12加样器(20～100μL)，准确度±2%及一次性加样头。7.检测环境条件所有的实验应20℃～25℃室温中进行8.检测步骤8.1检测前准备8.1.1样品收集和准备a.不需要特殊准备，不需要病人禁食；b.血清和血浆都可使用，柠檬酸，肝素和EDTA等抗凝剂不会产生影响，但不能与其他药物并用；c.血液应以一般法收集，并要小心处理；d.自血清中去除纤维蛋白，自血浆中去除红血球，避免溶血；e.标本中若含氮化钠或微粒物质会产生错误结果；f.高胆红素血、高溶血、乳糜血或高蛋白血标本通常会影响实验结果；g.标本中应无微生物，在2℃～8℃温度下，可保存一周，新鲜血液标本可长期保存在-20℃，标本要避免反复冻融；h.经一个冷冻/融化周期处理或在56℃30分钟的热灭活标本不会影响实验结果；i.标本上应有与其它标本分开产，并有明显标记(如HIV检测、姓名、编号或时间)。8.1.2检测试剂：本实验室采用珠海丽珠和英科新创两种人类免疫缺陷病毒HIV(12)型艾滋病病毒抗体酶联免疫检测试剂(双抗原夹心法)珠海丽珠 英科新创a.微量酶标板12×8孔； 微量酶标板12×8孔b.1瓶HIV阳性对照（1ml）， 1瓶HIV阳性对照（1ml）c.1瓶HIV阴性对照（1ml）； 1瓶HIV阴性对照（1ml）d.1瓶(50mL/瓶)浓缩洗涤液(20×)； 2瓶(25mL/瓶)浓缩洗涤液(20×)e.显色剂A、B液(7mL各1瓶； 显色剂A、B液(7mL各1瓶；f.1瓶HIV终止液(7mL/瓶)； 1瓶HIV终止液(7mL/瓶)g.1个自封袋； 1个自封袋h.2张封板膜。 2张封板膜8.2检测步骤第2页共7页8.2.1将标本、试剂和需要数量的微孔放置室温平衡(约15至30分钟)；8.2.2配液：将浓缩洗涤液(25×)用蒸馏水或去离子水稀释至使用量备用；8.2.3编号：将样品对应微孔按序编号，每板设空白孔1孔、阴性对照3孔、阳性对照2孔；8.2.4加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照50μL、空白孔不加任何物；8.2.5温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；8.2.6洗涤：小心将封板膜揭掉，至洗板机上洗涤6遍；8.2.7加酶：除空白孔外，其余孔加酶标记物50ul（英科新创试剂则加100ul）8.2.8温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；8.2.9洗涤：小心将封板膜揭掉，至洗板机上洗涤6遍8.2.8显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置37℃避光显色30分钟；（英科新创试剂则20分钟）；8.2.9测定：每孔加终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长于450nm处(建议用双波长检测，参比波长630nm)，使用广州华鑫HSELx80x酶联免疫检验分析系统操纵美国宝特ELX800酶标仪测定各孔OD值，和计算CUTOFF值。8.3操作注意事项8.3.1待检标本和试剂盒(含有人血成分)及废弃物有潜在传染性，应严格遵守消毒隔离
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；8.3.2不要用嘴吸吸管；8.3.3实验操作后应立即去除手套，用清洁液洗手；8.3.4避免标本溅出，污染环境；8.3.5避免皮肤粘膜接触H2SO4，如接触到这些试剂应立即用水冲洗；8.3.6每次实验完毕，必须作一次性严格消毒；8.3.7不能使用过期试剂8.3.8试剂必须保存在2℃～8℃环境中；8.3.9不同批号试剂不能混用，不得使用其它公司的洗液8.3.10封板膜不能重复使用；8.3.11加液器应经常校正；8.3.12加样时要小心，不要使吸头碰着酶标板孔上的包被抗原或抗体层；第3页共7页8.3.13洗板完毕应将板扣干，扣板应使用一次性吸水纸，不得重复使用，吸水纸应保持干燥；8.3.14标本、试剂和微孔条在使用前应放室温(20℃～25℃)平衡15～30min，未用完的微孔用自封袋密封保存；8.3.15严格按说明书的时间操作，避光显色后立即加入终止液，并立刻测量OD值。9.检测记录和数据处理9.1使用广州华鑫公司HSElx酶联免疫检验分析系统可以直接操纵ELX800酶标仪，直接进行OD值读数并进行自动计算分析实验结果；9.2计算：NC=阴性对照平均的OD值，PC=阳性对照平均的OD值；9.3阴性对照的正常范围：正常情况下，NC必须≤0.12，9.4阳性对照的正常范围：正常情况下，PC必须≥0.80，9.5确定NC的均值；9.6确定PC的均值；9.8临界值(CUTOFF)计算：丽珠试剂临界值=NC的均值0.15。英科新创试剂临界值=NC的均值0.1010.结果判断10.1样品OD值≥CUTOFF值者为阳性，样品OD
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