实验五 用IPTG诱导大肠杆菌
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达重组绿色荧光蛋白一、目的
要求
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1.学习和掌握重组蛋白在大肠杆菌中表达的原理和实验技术；2.观察大肠杆菌在诱导过程中的形态。二、原理pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定(详见I.F.部分)。如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种
方法
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启动目的蛋白的表达：用带有受λpL和pI启动子控制的T7RNA聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因的表达型细胞。在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。尽管有时(例如非毒性目的蛋白)可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。三、试剂与器材试剂：LB培养基、IPTG、氨苄青霉素、草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。器材：摇床、显微镜等。四、操作步骤A、诱导许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。1. 对照菌和重组菌分别挑取1～2个菌落，接入1ml含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养液，37℃培养过夜。大肠杆菌在室温的生长速率比在37℃慢4倍，所以～20℃培养过夜（16h）可能达不到饱和。但低温时细菌代谢缓慢，不容易形成包涵体。2. 取400μl过夜培养物接入40ml含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数中期（A550=0.5～1.0）。3. 在40ml培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续振荡培养。IPTG的浓度对表达水平影响非常大。1mmol/L只是一个起点，也是一个比较高的浓度。实验中，应在0.01～5.0mmol/L的范围内改变IPTG浓度，寻找最佳使用浓度。对于有些蛋白，必须诱导表达质粒慢转录，才不致于使细菌的生物合成系统过载。4. 在诱导的前后取1ml样品放于微量离心管中，测定A550，室温高速离心1min。留样并观察形态。B、形态观察1、涂片将诱导前后的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。2、染色（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗（3）脱色将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30分钟，立即用水冲净酒精。（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。（5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。注意事项革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。五、思考
题
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(1)列举并说明影响重组蛋白在大肠杆菌中表达的因素。(2)大肠杆菌形态若有变化，请阐述可能的原因。参考：分子克隆实验指南，第三版。
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