口腔微生物的饥饿游戏PNAS|口腔微生物的饥饿游戏美格基因余结莹NASA发现“超级地球”可能宜居，在移居之前，地球上各个生物都在争夺自我需要的生存资源。如同今日佳作中的主角上演一场激烈的饥饿游戏，详情请往下翻阅！口腔微生物经过饥饿培养后的幸存者：克雷伯氏菌和普罗维登斯菌属KlebsiellaandProvidenciaemergeaslonesurvivorsfollowinglong-termstarvationoforalmicrobiota作者：JonathonL.Baker,ErikL.Hendrickson,XiaoyuTa...
PNAS|口腔微生物的饥饿游戏美格基因余结莹NASA发现“超级地球”可能宜居，在移居之前，地球上各个生物都在争夺自我需要的生存资源。如同今日佳作中的主角上演一场激烈的饥饿游戏，详情请往下翻阅！口腔微生物经过饥饿培养后的幸存者：克雷伯氏菌和普罗维登斯菌属KlebsiellaandProvidenciaemergeaslonesurvivorsfollowinglong-termstarvationoforalmicrobiota作者：JonathonL.Baker,ErikL.Hendrickson,XiaoyuTang,RenateLux,XuesongHe,AnnaEdlund,JeffreyS.McLean,andWenyuanShi期刊：PNAS时间：2019.04影响因子：9.58一、研究背景众所周知，细菌为了在灾难性环境中存活进化出许多调控机制，包括应激反应基因表达和突变而得的代谢优势。尽管人类对这些调控机制已经深入了解，但对这些能在复杂生态环境中利用调控机制获得竞争优势的物种的动态适应过程知之甚少。过往研究发现，大肠杆菌群体在饥饿条件下培养3天开始进入快速死亡期，死亡总数超过99%，随后进入长期稳定期，在此期间携带有利突变如能通过代谢氨基酸作为能源的亚群开始活跃并且成为优势菌群。同样的变化规律也适用在复杂的微生物群落中，菌株的相对丰度的变化取决于谁更能适应不断变化的环境。目前缺乏关于人类相关复杂微生物群体在饥饿状态的研究，作者为了完善这部分的认知，利用16S扩增子、宏转录组、细菌基因组和代谢组的手段研究口腔微生物群体在饥饿培养100天中的变化动态，发现具有耐药性的致病肠杆菌科细菌具有绝对的竞争优势。二、实验结果1、口腔微生物在饥饿状态的动态变化作者从6位健康成年人取6份唾液混合后在SHI培养基和最佳生长条件下进行体外过夜培养，让口腔微生物群落达到最高多样性后，收集样品分别转移到PBS溶液和PBS与无细胞唾液1:1混合液（以下简称为混合液）中饥饿培养100天。与大肠杆菌的饥饿实验相似，在饥饿培养下，口腔微生物群体首先进入了快速死亡期，在45天后进入稳定期（图1.A）。值得注意的是，口腔中有部分微生物无法在体外存活，因此实验结果可能是低估其真实微生物总数，但对其整体变化预估还是可靠的。为了确定样品中的微生物组成，作者针对16SrRNA的V3-V4区进行二代测序，结果显示在混合液中的微生物α多样性明显高于在PBS中（图1.B）。图1.A:样品细菌总量统计；B：α多样性统计在饥饿实验期间，许多细菌的相对丰度发生变化，其中肠杆菌科的细菌总量出现明显的增长，尤其是克雷伯氏菌，而链球菌作为初始丰度最高的菌属，在饥饿期间丰度却不断下降（图2.左）。考虑到收集到的样品含有死细菌的DNA，掩盖了真实的物种组成情况，作者取不同时间点收集到的样品接种到新鲜SHI培养基中过夜培养后再收集样品进行16S测序，发现肠杆菌科细菌的真实增长情况更为显著，克雷伯氏菌仅在饥饿4天后相对丰度急速上升，到饥饿12天时，其比例已经达到90%以上（图2.右）。同时，作者取饥饿0、4、20、84和100天的样品接种到SHI琼脂培养基再挑取单克隆对16S全长一代测序和鉴定，结果再次说明饥饿后期只剩下具有抗药性的克雷伯氏菌等细菌存活（图2.下）。图2.左：饥饿期间细菌相对丰度堆叠图；右：饥饿期间细菌再培养的相对丰度堆叠图；下：饥饿期间细菌涂板实验2、宏转录组证实肠杆菌科在饥饿后期的活跃在饥饿0、4、20、84和100天取样进行宏转录组测序，用Metaphlan2分析细菌相对丰度，发现在饥饿20天后以克雷伯氏菌为代表的肠杆菌科细菌相对丰度增加，原本多样性丰度的链球菌相对丰度下降，在饥饿100天后肠杆菌科细菌比例已经达到90%以上（图3）。作者将宏转录组数据分别比对到克雷伯氏菌等典型的肠杆菌科细菌的基因组，发现在饥饿20天后，鞭毛运动的负调节、生物膜形成的负调节和碳水化合物的正调节高度活跃，推测是肠杆菌科细菌师徒保存能量并且被动地转移至营养丰富的地方来保持继续增殖，为解释肠杆菌科细菌再饥饿条件下生存提供了研究思路。图3.宏转录组注释圈图3、饥饿期间肠杆菌细菌SNP积累将饥饿0、20和84天的肠杆菌科单克隆进行全基因组测序，分析发现在克雷伯氏菌中存在非同义突变（SNP），主要分布在Lys转录因子家族和麦芽糖蛋白基因等与适应新生长条件强烈相关的基因上，目前虽无法得知这些SNP是否有助于肠杆菌科细菌适应饥饿条件，但是对高频SNP还是具有一定的研究意义。4、代谢组分析证实肠杆菌科细菌产生环状缩酚酸肽作者通过液相色谱法分析群落、单克隆以及培养上清物的成分，只有40%的谱图得到注释，其中缬氨酸在饥饿后期的含量明显上升，与宏转录组中国肠杆菌科细菌中的缬氨酸合成通路上调一致（图4）。在代谢组中检测到具有抗菌作用的环状所酚酞，再结合肠杆菌科细菌在饥饿后期大量增殖，可以推测环状所酚酞是由肠杆菌科细菌释放用于杀死邻近细菌以争取更多的生长空间，这点值得深入研究。图4.代谢组检测物质的丰度热图5、DGGE验证饥饿期间物种变化情况作者为了确保结果可靠性，从另外5位健康人分别获得唾液样本进行同样的饥饿实验，使用变形凝胶电泳（DGGE）检测饥饿实验的前20天中群落的变化，同样发现肠杆菌科细菌在饥饿期间大量增殖，而其它细菌的比例不断下降，再次说明肠杆菌科细菌是以其它细菌为代价进行增殖。三、亮点1、作者关注的问题很新颖；2、在实验设计上的非常严谨缜密；3、同时利用了多组学等其他方法结合进行研究，结论可靠性强。
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