实验2大肠杆菌质粒DNA的提取1.实验目的学习提取质粒DNA的
方法
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，并掌握提取质粒DNA的原理。2.实验材料、主要仪器及试剂材料：pUC系列质粒主要仪器：超净工作台、低温离心机、恒温水浴锅、微量移液器、培养箱、摇床、紫外观测仪和琼脂糖凝胶电泳系统等。主要试剂： （1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·HCl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）灭菌后4℃保存（2）溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（现用现配）1%SDS（pH值12.6）（3）溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml（pH4.8）（5）LB培养基4.质粒DNA提取与回收（1）菌体的培养与收集从LB平板上挑细菌单菌落，接种于5ml附加相应抗生素的LB液体培养基中，37℃250r/min，过夜培养，用对数期的菌液提取质粒得率高，即测定培养液的OD620=0.2～0.6时为对数期的菌液。也可取1/100的过夜菌液，继续摇瓶培养2.5h，此时菌液达对数期。取1.2ml菌液，5000r/min4℃离心10min，弃上清（上清液中含有细菌生长过程中的代谢废物和脱落的细胞壁成分，会影响到质粒的质量与内切酶酶切的效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除干净，最好用STE或生理盐水再悬浮漂洗菌体）。收集细菌后可选择以下方法提取质粒。（2）质粒DNA的提取（碱裂解法）①将收集的细菌沉淀悬浮于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中，强烈振荡混匀；②加入200ul新配的溶液Ⅱ于细菌悬液中，迅速颠倒离心管5次（不应振荡），以混合
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物，室温放置5min或冰上放置3min③加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒离心管5～10次，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将管置于冰上5～10min。 ④12000r/min离心10min，取上清。用等体积的酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。⑤12000r/min4℃离心5min，取上清，加入2倍体积的无水乙醇，室温30min。⑥12000r/min4℃离心10min，弃上清，吸净管壁上的水。⑦加入500μl75%乙醇洗2次，气干。⑧溶于50μlTE中（含RNase 20μg/ml），-20℃保存中使RNA逐渐降解。交实验报告作业（1）提取的质粒DNA的质量与产量与哪些因素有关？为什么要用对数期的菌液提取质粒？（2）碱法提取质粒DNA过程中，加入的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的各有何作用？（3）为何要纯化质粒DNA？（4）碱裂解法的原理是什么？（5）碱裂解法中溶液Ⅱ变性时间为什么不易过长？
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