Ni-NTA常见问题及建议纯化的组分中没有His标签的蛋白?首先确定是蛋白没有挂上柱还是蛋白没有被洗脱下来。若His标签蛋白没有与柱结合：可能原因：超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶可能原因：样品或者是结合缓冲液不正确：策略：检测pH及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。可能原因：组氨酸标签暴露不完全策略：在变性条件下(用4-8M脲，或4-6M盐酸胍)进行纯化。可能原因：His标签丢失策略1：WB检查His是否
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达，上游构建，改变His-tag的位置(C-端或N-端)，必要时增加His个数。策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。Ni2通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数6×His标记的重组蛋白质的首选金属离子。也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用Ni2。His标签蛋白若没有洗脱下来，请依次检查：可能原因：洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH来找出最佳的洗脱条件。可能原因：降低pH的
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洗脱的，因为若pH低于3.5，会导致镍离子脱落策略：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱可能原因：蛋白已沉淀在柱上策略：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4-8M脲，或4-6M盐酸胍)。可能原因：非特异性疏水或其他相互反应策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如：2%TritonX-100）或增加NaCl的浓度。His标签蛋白洗脱后杂带较多，什么原因?如何优化?高纯度的蛋白是纯化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也会带有HIS，所以经常会出现HIS标签蛋白洗脱后有一些杂带，可能的原因和优化的方法如下：可能原因：蛋白酶部分降解了标签蛋白策略：请添加蛋白酶抑制剂。可能原因：杂质对镍离子有更高的亲和性策略1：咪唑浓度必须优化，以确保高纯度(宿主细胞蛋白质的低结合)和高产率(组氨酸标记的目标蛋白质的强结合)之间的最佳平衡。分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度；在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑；咪唑的梯度不大(20个或更多的柱床体积)，可能分离出有相似结合强度的蛋白策略2：筛选最适合的缓冲液条件，NaCl浓度，pH的范围都需要进行筛选。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时，将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成不同的混合配方来进行优化。策略3：若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白，需要考虑多步纯化的思路，如利用Strep标签进行两步纯化或采用Subtractivemethod进行纯化。可能原因：杂质和标签蛋白结合在一起策略：在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂；增加去垢剂的浓度(2%TritonX-100or2%Tween20)；或者在Washbuffer中增加甘油的浓度(50%)减少非特异性的相互反应；考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。可能原因：洗涤不充分策略：增加洗涤的次数，使洗涤充分。
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