Car-T细胞培养
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
操作
流程
快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计
1目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。2范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养3责任人：实验员人、临床相关人员。4内容4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管4.2试剂：X-VIVO15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。4.3环境：4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。4.4操作：4.4.1采集接收外周血4.4.1.1患者符合治疗
方案
气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载
，各项
检测
工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训
符合要求，采集患者外周血60-80ml。4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。4.4.2操作前准备4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。4.4.2.3生物安全柜
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。4.4.4细胞培养：4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150200x106/100ml,T75100x106/50ml,T2550x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120mlinaT150，50-60mlinaT75，15-29mlinaT25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。4.4.5Car-T细胞收集：4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。4.5细胞运输与保存：4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。
浙公网安备 33021202002483