实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定一、实验目的与要求1.掌握蛋白质的两性解离性质；2.熟练掌握测定蛋白质等电点的基本方法。二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物。虽然大多数的α-氨基和α-羧基成肽键结合，但仍有N末端的氨基和C末端的羧基存在，同时侧链上还有一些可解离基团。因此，蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节蛋白质溶液的pH，可使蛋白质带上正电荷或负电荷；在某一pH时，其分子中所带的正电荷和负电荷相等，此时溶液中蛋白质以兼性离子形式存在。在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质，因氨基酸的组成不同有不同的等电点。三、实验材料、试剂与仪器1.材料与试剂NaOH、HCl、乙酸、溴甲酚绿、酪蛋白、精密pH试纸等。0.5%酪蛋白溶液：0.5g酪蛋白，先加入几滴1mol/L的NaOH使其湿润，用玻璃棒搅拌研磨使成浆糊状，逐滴加入0.01mol/L的NaOH使其完全溶解后定容到100mL.酪蛋白—乙酸钠溶液：将0.25g酪蛋白加5mL1mol/L的NaOH溶解，加20mL水温热使其完全溶解后，再加入5mL1mol/L的乙酸，混合后转入50mL的容量瓶内，加水到刻度，混匀备用（pH应为8~8.5）；0.01%的溴甲酚绿溶液：将0.01g溴甲酚绿溶解于100mL含有0.57mL0.1mol/L NaOH的水中。该指示剂的变色范围是：酸性（pH3.8）为黄色，pH5.4为蓝色；0.02mol/L的HCl溶液：将0.8mL浓盐酸用蒸馏水稀释到480mL即可；0.02mol/L的NaOH溶液：将0.8gNaOH溶解于100mL水中，最终加入到1000mL；0.1mol/L的乙酸溶液：将1mL冰醋酸用水稀释到170mL；0.01mol/L的乙酸溶液：将0.1mL冰醋酸用水稀释到170mL；1mol/L的乙酸溶液：1mL冰醋酸（17mol/L）加水到17mL即可。2.仪器试管、滴管、移液管、pH试纸等。四、实验方法与步骤1.蛋白质的两性反应1）取一支干净的试管，加入20滴0.5%的酪蛋白溶液，逐滴加入0.01%的溴甲酚绿溶液（约5~7滴），充分混合，观察溶液的颜色并解释（蓝色）。2）逐滴加入0.02mol/L的HCl，随加随摇动试管，直到出现明显的沉淀为止，用精密pH试纸测溶液的pH，观察溶液的颜色变化。3）继续加入0.02mol/L的HCl，观察沉淀的变化和溶液颜色的变化。4）逐滴加入0.02mol/L的NaOH到上面的溶液中，使溶液的pH接近中性，观察沉淀是否形成。5）继续滴加0.02mol/L的NaOH，观察沉淀的变化。2.酪蛋白等电点的测定1）取9只试管分别编号1~9.2）按下
表
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向每管中加入试剂。注意，每种试剂加完后，要振荡试管。3）试剂全部加完后，静置20min。4）观察每管内溶液的混浊度，用“”、“-”表示沉淀的多少。5）判断酪蛋白的pI是多少？试管号水/mL1mol/LHAc/mL0.1mol/LHAc/mL0.01mol/LHAc/mL酪蛋白醋酸钠溶液/mL溶液最终的pH沉淀多少1234567892.43.2—2.03.03.51.52.753.381.60.8—————————4.02.01.00.5—————————2.51.250.621111111113.53.84.14.44.75.05.35.65.9五、思考题1.何谓蛋白质的等电点？在等电点时蛋白质的溶解度最低，为什么？2.本实验中，根据蛋白质的何种性质测定其等电点？3.测定蛋白质等电点为什么应在缓冲液中进行？
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