在排除了其他问
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
后，我做了摩尔比的调整，需要做OD260的测量。不要怕浪费回收的载体和片段因为实际用量非常少，看了下面我们的实验实例就知道了。摩尔比是指载体和插入片段，在连接时的摩尔比。1 比例应该在1:2-6之间（载体：片段；片段要多）。2 连接体系如果是20微升，载体和片段的总质量（微克）要在0.02微克~0.2微克之间。如果是10微升，则在0.01~0.1微克之间。我一般都用到接近上限。3 EDTA不能太多。否则可能影响连接酶。附加：如何计算摩尔数和微克数（用20微升的链接体系，NEB的T4DNAligase）公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数实例：片段大小=555bp=0.555kb，浓度=0.19微克/微升载体大小=4.969kb， 浓度=0.115微克/微升选取：载体0.04pmol；片段0.12pmol（载体：片段=1:3）代入公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数；载体用0.129微克（1.12微升）；片段用0.043微克（0.23微升）：：：注意20微升体系得出：载体和片段的总质量=0.0430.129=0.172微克（在20微升体系所要求的0.02~0.2微克之间）连接体系：体积按需调整，我们喜欢用20ul的体系。你如果要用10ul的，把上述用量减半。20ul体系：3d水 15.65ul，片段 0.23ul，载体 1.12ul，将上面三个液体混匀，45摄氏度水浴5min，迅速插入冰中，2min保持在冰浴中，加入10×buffer 2ulT4DNAligase 1ul混匀，4℃连接过夜另外一种推算结果设x1为DNA片段pmol数，x2为其ug数；设y1为载体pmol数，y2为载体ug数，a为DNA片段的kb数，b为载体的kb数，并且假定摩尔比为DNA片段：载体=3:1，则有x1·a·0.65=x2y1·b·0.65=y2x1：y1=3x2y2=0.2（总质量）最后提示：不要怕测OD260浪费了回收的载体和片段，因为实际上用的很少（见上述）。不要嫌测OD值麻烦，因为非常必要，尤其是连接效率不高的质粒和片段。根据酶切电泳条带估计用量通常都不能得到最大的连接效率，对初学者来说，估计通常不准。我有一次，按照估计的，两个板子才有一个克隆；按照摩尔比1:3连接得到了大约150个克隆；按照摩尔比1:10只得到了平均15个克隆/板。这说明：片段过多，过犹不及。
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