pcr学习整理(1)

PCR聚合酶链式反应：聚合酶链式反应,又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。反应体系与反应条件 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5u/ulMg21.5mmol/L 加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2)标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。实时定量PCR定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。阈值：在荧光的增长曲线上人为地设定一个值。标准偏差：(StdDev)-统计学名词。一种量度数据分布的分散程度之标准，用以衡量数据值偏离算术平均值的程度。标准偏差越小，这些值偏离平均值就越少，反之亦然。标准偏差的大小可通过标准偏差与平均值的倍率关系来衡量。标准偏差公式：本底：本底值是指没有进样时检测器的信号值.本底值大小和检测器类型有关。荧光域值（ threshold）： 以PCR反应的前15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3---15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。Ct值：值得是实时监测扩增过程的荧光信号达到指数扩增是的循环周期数。计算方式是以扩增过程前的3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数（ct）.Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。绝对定量：是使用一系列稀释的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓度标准品的ct值与骑士模板（RNA或cDNA）量之间的线性比例关系，绘制标准曲线。可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度。相对定量：在相对定量中，标本中特定mRNA的测定时建立在外标或参比样本（校准品）的基础上的。当使用校准品的时候，定量测定结果可 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示靶RNA/校准品比值。保准品（standard）：用来构建标准曲线的已知浓度的样本。Taqman探针是RNA探针。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。FAM是常用的荧光基团，连接在Taqman探针的5’末端TaqDNA聚合酶：从水生栖热菌ThermusAquaticus（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。与一般酶不同,用Taq酶扩增DNA时常使片段3'端凸出一个A,应注意.可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。TaqDNA聚合酶是Mg2依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2浓度非常敏感.以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.7～0.8mmol/L时，用不同浓度Mg2进行PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在10mmol/L时可抑制40～50%的酶活性.由于Mg2能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离的Mg2浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应中Mg2浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L.适当浓度的KCL能使TaqDNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶的活性PCRbuffer：是PCR反应的缓冲液的目的是给TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。一般常用的10*PCRbuffer的成分为：Tris-HClpH8.5 100mM、KCl500nM、MgCl215nM质粒：质粒是细菌拟核裸露DNA外的遗传物质，为环形闭合的双股DNA,存在于细胞质中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。阳性对照：找个原来P出来的模板~这用来排除体系问题阴性对照：模板换水~排除引物问题阳性对照就是加入你以前能克隆的得到条带的引物和模板，这样你就能知道你的体系是可以扩出来东西的。而阴性对照就不一样了，你可以不加引物，不加模板，或者不加其他体系中的东东，老看看你的体系有没有污染，或者来检测你的体系中哪一个东东污染了。这和内参是不一样的，不是一个概念。内参一般是来做对照组，排除干扰的，或者是别的用途。阴性对照如果用水来做的话，别的东西都不加，这样没有意义。你的意思如果是体系中更没有模板，而只有水和其他pcr体系中的东东，那么就可以检测你的体系终是否存在其他的模板，可以检测你的体系污染与否，但是这是一个综合的指标。我们一般做的阴性对照就是只加水，不加模板。pcr中内参照基因：内参就是对照基因，在PCR中，就是肯定能用PCR扩增出来的基因，无论你要扩增什么生物，比如你做的是真菌，都可以扩的出来。阳性对照的目的，有两个：一个是帮助你判断你的PCR扩增的过程中有没有出现什么问题，比如说加样过程中会不会漏加某些试剂，以判定你的PCR体系有没有问题。另一方面，就是用来检测你的目的蛋白的表达量。这个意思是说，内参一般选用在很多组织和细胞中中都是稳定表达的基因，比如actin,tublin，他们在整个生长过程中表达稳定，因此，以他们作为参照，看你的目的蛋白表达量的多少。也就是说，条带浓度低比内参低，就是表达比内参低，是一种半定量的标准。影响PCR的主要因素：温度1.模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。2.引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，过高引物不能与模板牢固结合，扩增效率下降；温度低产量高，过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。3.引物延伸温度温度的选择取决于TaqDNA聚合酶的最适温度。循环次数常规PCR一般为25～40个周期。引物1.引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次。2.引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”。3.引物3’端配对DNA聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸，所以，引物3’端5～6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。DNA聚合酶1.引物3’端配对DNA聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸，所以，引物3’端5～6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。2.影响酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2离子的影响。第二代耐热DNA聚合酶Stoffel片段。3.RTth逆转录酶的发展很快，所以对耐热的依赖于RNA的DNA多聚酶的研究也有进展。单位换算：1摩尔（mol）＝1000毫摩尔(mmol)1毫摩尔(mmol)＝1000微摩尔(μmol)1微摩尔(μmol)=1000纳摩尔（nmol）1纳摩尔（nmol）=1000皮摩尔（pmol）引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～1μmol/L之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。三磷酸腺苷（ATP）：ATP的立体结构ATP可通过多种细胞途径产生，最典型的如在线粒体中通过氧化磷酸化由ATP合成酶合成，或者在植物的叶绿体中通过光合作用合成。ATP合成的主要能源为葡萄糖和脂肪酸。每分子葡萄糖先在胞液中产生2分子丙酮酸同时产生2分子ATP，最终在线粒体中通过三羧酸循环产生最多36分子ATP。磷酸化：生物分子结合磷酸基团的过程。磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或加在蛋白质（protein）上的过程。磷酸基团的添加或除去（去磷酸化）对许多反应起着生物“开/关”作用。磷酸基团的添加或除去能使酶（enzyme）活化或失活，控制诸如细胞分裂这样的过程。添加磷酸基团的酶称为激酶（kinases）；除去磷酸基团的酶称为磷酸酶。磷酸化就是通过磷酸转移酶在底物上加上一个磷酸基团。在生物方面：磷酸化（英语：Phosphorylation）或称磷酸化作用，是指在蛋白质或其他类型分子上，加入一个磷酸（PO4）基团，也可定义成“将一个磷酸基团导入一个有机分子”。此作用在生物化学中占有重要地位。蛋白质磷酸化可发生在许多种类的氨基酸（蛋白质的主要单位）上，其中以丝氨酸为多，接着是苏氨酸。而酪氨酸则相对较少磷酸化的发生，不过由于经过磷酸化之后的酪氨酸较容易利用抗体来纯化，因此酪氨酸的磷酸化作用位置也较广为了解。除了蛋白质以外，部分核苷酸，如三磷酸腺苷（ATP）或三磷酸鸟苷（GTP）的形成，也是经由二磷酸腺苷和二磷酸鸟苷的磷酸化而来，此过程称为氧化磷酸化。另外在许多糖类的生化反应中（如糖解作用），也有一些步骤存在氧化磷酸化作用。受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase,RTKs)：细胞表面一类具有细胞外受体结构域、可使酪氨酸磷酸化的穿膜受体蛋白。具有细胞外受体结构域的酪氨酸激酶，膜外信号物质结合受体部分后激活其细胞内的激酶活性域，从而对底物的酪氨酸残基进行磷酸化。在细胞信号的穿膜转导中起作用。各类受体酪氨酸激酶RTKs是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是酶，能够同配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的RTKs都是由三个部分组成的：含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶（RTK）活性的细胞内结构域。已发现50多种不同的RTKs,主要的几种类型包括：①表皮生长因子（epidermalgrowthfactor,EGF）受体；②血小板生长因子（platelet-derivedgrowthfactor,PDGF）受体和巨噬细胞集落刺激生长因子（macrophagecolonystimulatingfactor,M-CSF）；③胰岛素和胰岛素样生长因子-1（insulinandinsulin-likegrowthfactor-1,IGF-1）受体；④神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）受体；⑤成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactor,FGF）受体；⑥血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）受体和肝细胞生长因子（hepatocytegrowthfactor,HGF）受体等。受体酪氨酸激酶在没有同信号分子结合时是以单体存在的，并且没有活性；一旦有信号分子与受体的细胞外结构域结合，两个单体受体分子在膜上形成二聚体，两个受体的细胞内结构域的尾部相互接触，激活它们的蛋白激酶的功能，结果使尾部的酪氨酸残基磷酸化。磷酸化导致受体细胞内结构域的尾部装配成一个信号复合物（signalingcomplex）。刚刚磷酸化的酪氨酸部位立即成为细胞内信号蛋白（signalingprotein）的结合位点，可能有10～20种不同的细胞内信号蛋白同受体尾部磷酸化部位结合后被激活。信号复合物通过几种不同的信号转导途径，扩大信息，激活细胞内一系列的生化反应；或者将不同的信息综合起来引起细胞的综合性应答（如细胞增殖）。HER2：HER2是一种位于乳腺和乳腺癌细胞表面的受体，能够控制癌细胞的生长、浸润和癌细胞的转移，大约20的乳腺癌病例中HER2基因和/或蛋白水平增加，这些HER2阳性的肿瘤是一种高危肿瘤，对某些常规的化疗和激素治疗反应性差，通常预后不好。为此，多种阻断HER2的抗癌药物相继问世，其中目前最为常用并经FDA批准的此类药物是曲妥珠单抗(赫赛汀)，适用于治疗HER2过度表达的乳腺癌。由于这种药物只有针对HER2基因扩增和蛋白过度表达的病人才有效，因此准确评价HER2基因和蛋白水平是至关重要的。水系列热原：引入或释放到体内后能引起发热的物质。热原系（pyrogen）指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。血源筛查的定义：由于通过血液可以传播乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病和梅毒等多种严重的传染病。为了保障临床用血的安全，血液制品的质量，防止供受血之间的交叉感染和采血及血液制品工作者的健康，必须防止上述疾病的感染者进入供血队伍，防止上述疾病病原体阳性血浆直接输注病人或用于血液制品生产。为此必须用当前质量最好、最可靠的诊断试剂筛查供血员及其血样。血源筛查的样本数不少于10000例。血源筛查范围，是指HBsAg-ELISA，抗-HCV-ELISA，抗-HIV-ELISA，梅毒检测试剂（ELISA，TRUST等）。实时荧光定量PCR的染料、探针等试剂药品是否有毒，是否会对人体造成危害？试剂药品无非就是酶BUFFER可以认为基本无毒根据不同方法进行荧光定量PCR你可能会用到SYBRGreenI或者带有荧光基团的探针探针本身是无毒的(DNA),荧光基团只要不进入你的身体里问题也不大(做实验后洗手)SYBRGreenI好象是有毒的但和EB比起来毒性要小的多了用时带上手套就好了而且它又不会挥发总之不要太担心做实时荧光定量PCR对人体基本无害。