1 目的为规范人羊膜来源间充质干细胞原代分离培养的标准操作，特制订本规程。2范围适用于酶消化法分离培养人羊膜来源间充质干细胞的生产工艺流程。3
职责
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技术人员负责实施本规程，质量控制人员负责监督技术人员的实际操作和相关记录。4工作程序4.1材料健康胎盘羊膜组织4.2仪器设备超净工作台、倒置显微镜、CO2培养箱、电动移液枪、手动移液枪、离心机、37℃恒温气浴摇床、Countstar计数仪、计时器。4.3试剂耗材4.3.1试剂完全培养基（高糖DMEM培养基10%FBS1%NEAA）、1ug/mLEGF、PBS缓冲液、0.5%I型胶原酶、胰蛋白酶（0.25%胰酶0.02�TA）、75%酒精、95%酒精、0.4%台盼蓝。4.3.2耗材50mL离心管及离心管架、15mL离心管及离心管架、一次性移液管（2mL、10mL、25mL）、巴氏吸管、EP管及EP管架、10cm培养皿、移液枪头（10uL、200uL、1000uL)、镊罐、酒棉罐、酒精灯、酒精喷壶、打火机、无菌纱布无菌、250mL一次性储液瓶。4.3.3器具4.3.3.1羊膜制作包1（1个肾形盘，2把18cm平镊、2把16cm止血钳、2把16cm组织镊、2把12.5cm眼科剪、2把16cm弯剪、2把16cm直剪）。4.3.3.2羊膜制作包2（2把18cm平镊、2把16cm直剪、2把16cm组织镊）4.3.3.3无菌100ml烧杯、、无菌15cm玻璃培养皿、无菌粗漏、无菌100目筛网、无菌废液杯、无菌不锈钢方盘。4.4操作步骤4.4.1入洁净区之前用抑菌洗手液洗手，用75%酒精擦拭消毒双手，按照规定穿洁净服、戴口罩、戴帽子和手套。4.4.2开恒温气浴摇床预热，打开超净台紫外灯消毒30min。同时将实验所需培养基、0.5%I型胶原酶、胰蛋白酶、PBS缓冲液放置室温。4.4.3关紫外灯，打开通风10min，用无菌纱布单向擦拭消毒超净台，点燃酒精灯。所有物品进入超净工作台前需用75%酒精消毒。4.4.4打开羊膜制作包1和羊膜制作包2外包装，用75%乙醇消毒后放进超净台。PBS缓冲液、培养液以及样本用75%乙醇消毒后放进超净台。打开装有胎盘的采集盒，用巴氏吸管吸取2mL浸泡胎盘的液体，分装至2个EP管中，1mL/管，一份留样，一份送检至质控部。4.4.5用18cm组织镊或止血钳夹住中间部位用直剪把整个羊膜剪下来放入15cm玻璃培养皿中，用眼科剪剪去血块和损伤较严重的部位，转移羊膜至三个分别装有PBS的15cm玻璃培养皿，共漂洗3-4次到PBS溶液澄清为止。4.4.6用直剪将羊膜剪成适度小块（6×6cm2的面积），分至4支50mL离心管中（体积不超过15mL），加胰蛋白酶到45mL刻度处，盖上盖子，封口膜封口。4.4.7将4支50mL离心管放入37℃，250r/min恒温气浴摇床中消化30min，每10min取出用手剧烈摇晃。4.4.8将消化好的组织块依次转移至三个装150mLPBS一次性储液瓶中，盖好盖子用手剧烈摇晃，漂洗3次。4.4.9将漂洗好的组织块转移至100mL烧杯中用直剪剪碎成1mm3大小的组织块。4.4.10将剪碎的组织块转至一次性储液瓶中，加4倍组织块体积的0.5%Ⅰ型胶原酶，盖上盖子，封口膜封口，放入37℃，250r/min恒温摇床中消化1.5h，直至组织块完全消化。4.4.11取出消化好的组织液，加等体积完全培养基终止消化，用100目筛网过滤到4支50mL离心管中，配平后放入离心机内200g/min离心5min。4.4.12用巴氏吸管吸去离心后上清，每管加5mL完全培养基混匀后转移到2支15mL离心管中，取20uL细胞悬液用细胞计数仪计数，离心管配平后放入离心机内，200g/min离心5min。4.4.13用巴氏吸管吸约取2mL离心后上清，分装至2个EP管中，1mL/管、一份留样，一份送检至质控部；用巴氏吸管吸掉剩余的上清液，根据细胞计数结果，用完全培养基调整细胞接种密度为1×105cell/mL，用10mL一次性移液管接种10mL的细胞悬液至10cm的培养皿中，每皿添加100uL的1ug/mLEGF。十字摇晃培养皿5次，使细胞悬液均匀分布于培养皿中。4.4.14在培养皿盖上方做好标记（条形码、代数、批次、操作人、日期），转移至5%CO2、37℃、饱和湿度为95%的细胞培养箱中培养。4.4.1548h后，用巴氏吸管吸掉皿内培养基，每皿加入10mLPBS清洗，重复2次。4.4.16用10mL一次性移液管接种10mL的细胞悬液至10cm的培养皿中，每皿添加10uL的1ug/mLEGF。十字摇晃培养皿5次，使细胞悬液均匀分布于培养皿中，转移至5%CO2、37℃、饱和湿度为95%的细胞培养箱中继续培养，每天观察细胞状态并拍照。4.4.17填写相关记录。4.4.18清理超净台台面及细胞房4.4.19将废物经由废物传递出口传出分类处理，送检标本由样本传递出口传出，并在送样登记本上登记。5相关记录5.1《细胞制作单》5.2《实验记录》5.3《质控申请单》5.4《试剂耗材使用登记表》5.5《样本保存登记表》5.6《仪器使用记录表》
浙公网安备 33021202002483