第十四章第二次课

会计学1第十四章第二次课2第一节：DNA的重组第二节：重组DNA技术第三节：重组DNA技术与医学的关系本章主要内容第1页/共91页3回顾：DNA的重组：重组DNA技术相关概念：同源重组：最基本细菌的重组：接合、转化、转导、细胞融合特异位点重组：整合酶转座重组：插入序列、转座子DNA克隆工具酶：限制性内切酶目的基因基因载体第2页/共91页4二、重组DNA技术的基本原理与操作基本原理(基本过程)：目的基因的获取DNA导入受体菌目的基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选目的基因的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达第3页/共91页5SS基因基因载体重组体分切接转筛表SS第4页/共91页以质粒为载体的DNA克隆过程第5页/共91页7（一）目的基因的获取1.化学合成法2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)第6页/共91页8DNA合成仪已知核苷酸序列目的DNA（合成的片段较小）1.化学合成法获取目的基因：第7页/共91页91.化学合成法获取目的基因：由已知产物的氨基酸序列可以推测出基因可能的DNA序列。小分子活性多肽基因的合成，如：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及干扰素基因等。第8页/共91页10基因组DNA文库：存在于转化细胞内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。2.从基因组DNA文库获取目的基因：组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌第9页/共91页限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因组文库图14－11用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库第10页/共91页123.从cDNA文库获取目的基因：逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ酶/碱水解TTTT组织或培养细胞mRNAcDNA载体cDNA与载体DNA连接导入大肠杆菌鉴定cDNA文库的克隆数与特性第11页/共91页13DNA利用了DNA的变性和复制的机制：加热退火、延伸单链DNA复制的DNA双链引物、dNTP聚合酶PCR（polymerasechainreaction）:即聚合酶链反应技术，是一种在体外利用酶促反应快速扩增特定核酸片段的技术。4.聚合酶链反应(PCR)获取目的基因：第12页/共91页14PCR测序反应示意图变性(95℃)引物连接(Tm－5℃)半保留复制(72℃)反复循环第13页/共91页15PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增聚合酶链反应（PCR）第14页/共91页16目的基因克隆载体重组体（二）克隆载体的选择和构建克隆载体：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的载体。选择和构建合适的载体是基因工程成功的关键步骤。载体的选择和构建要根据基因工程的目的。目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改进 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 也不同。第15页/共91页17（三）外源基因与载体的连接将目的基因或序列插入载体（即DNA的体外重组），主要靠DNA连接酶。连接方式：1.粘性末端的连接2.平端连接3.同聚物加尾连接4.人工接头连接第16页/共91页18条件：末端碱基序列互补1.粘性末端连接：方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接（三）外源基因与载体的连接第17页/共91页19BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割DNA连接酶15ºC重组体同一限制酶切位点连接：第18页/共91页20不同限制酶切位点(配伍末端)的连接：配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。MboⅠ切割位点GATCCTAGBamHⅠ切割位点GGATCCCCTAGGCTAGGATCCGGATCCCTAGG第19页/共91页21不同限制酶切位点(非配伍末端)的连接：EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切DNA连接酶15ºC重组体连接方向一定第20页/共91页22限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：2.平端连接：第21页/共91页目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连平端连接第22页/共91页24在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。3.同聚物加尾连接：利用同聚物序列，比如多聚A与多聚T之间在退火作用下完成连接。属于粘性末端连接的一种特殊形式。这是人工提高连接效率的一种方法。第23页/共91页5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nTT(T)nT3´5´5´3´3´5´3´A(A)nAA(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4DNA连接酶15ºC重组体5´同聚物加尾连接第24页/共91页26由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。4.人工接头连接：对酶切产生的平端DNA片段，在连接前将磷酸化的接头连到平末端，使产生新的限制性核酸内切酶位点，再用识别新位点的限制性酶切除接头远端，产生粘性末端。也是粘性末端连接的一种特殊形式。第25页/共91页人工接头连接EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠCCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠ第26页/共91页28（四）重组DNA导入受体菌目的基因与载体在体外重组后要导入受体细胞才能进行扩增和表达。无性繁殖受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)第27页/共91页29导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)感受态细胞：选择合适受体菌后，可采取一些适当方法处理受体细胞，使其处于最容易接收重组体的状态，称为感受态细胞。细菌真核细胞哺乳动物第28页/共91页30（五）重组体的筛选筛选(screening)是从大量细胞克隆中，得到含有目的基因的阳性重组子细胞或菌落的过程。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞的表达情况不同，可采取相应的筛选方法。第29页/共91页311.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选第30页/共91页32（1）抗药性标志选择利用携带某种抗药性标志基因的克隆载体进行筛选;只有含这种抗药基因的转化细菌才能在含该抗生素的培养基上生存并形成菌落，从而区别转化菌和非转化菌。如质粒pBR322:含氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）。第31页/共91页33(插入失活法)抗药性标记选择6第32页/共91页34（2）标志补救是利用重组DNA和受体细胞之间基因产物的互补性来筛选重组体的方法。如:酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因、pUC质粒载体等第33页/共91页35组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救第34页/共91页依据蓝白菌落的出现筛选鉴定重组与非重组菌落。pUC质粒载体，含有为-半乳糖苷酶N-端-片段编码的基因突变型大肠杆菌可表达-半乳糖苷酶C-端的片段单独-片段或片段均无-半乳糖苷酶活性宿主细胞与克隆载体共表达时，才能形成完整的-半乳糖苷酶分解发色底物，形成蓝色菌落，称为-互补。不能形成完整的-半乳糖苷酶，形成白色菌落。α互补：第35页/共91页37α互补的检测第36页/共91页38（3）分子杂交法是利用探针与转移至硝酸纤维素膜上的DNA片段进行分子杂交。探针：放射性如32P标记，且与目的基因同源如：原位杂交、Southernblot。第37页/共91页39原位杂交第38页/共91页40Southernblot第39页/共91页41（4）免疫学筛选法适用于基因表达性载体的筛选原理：抗原（表达产物）与抗体的免疫反应优点：特异性强、灵敏度高。第40页/共91页重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交中文第41页/共91页43重组DNA技术：分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体表达第42页/共91页44（六）克隆基因的表达表达体系的建立:表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化基因工程的表达系统包括原核和真核表达体系。第43页/共91页45E.Coli表达体系的不足：①不宜表达真核基因组DNA②不能加工表达真核蛋白质③表达的蛋白质常形成不溶性包涵体④很难表达大量可溶性蛋白原核表达体系：E.coli表达体系最为常用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ：①选择标志②强启动子③翻译调控序列④多接头克隆位点E.Coli表达体系的优点：培养方法简单、迅速、经济，适合大规模生产工艺。第44页/共91页46优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济转染——将表达载体导入真核细胞的过程。真核表达体系：酵母、昆虫、乳类动物细胞方法：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染电穿孔、脂质体转染、显微注射第45页/共91页（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分。（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组。（3）外源基因的导入。（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选。（5）外源基因表达产物的生理功能的核实。（6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析。（7）生态与进化安全保障机制的建立。（8）消费安全评价。一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：第46页/共91页48第三节重组DNA技术与医学的关系非常密切并前景远大DNARecombinationTechniqueisCloslyRelatedwithMedicineandhasaGoodPerspective第47页/共91页49一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。脆性X综合征：(CGG)n重复序列Kallmann综合征：KALIG-1基因缺失突变比如：第48页/共91页5020世纪80年代，转基因微生物发酵，药用多肽；目前，转基因动物，人类活性多肽；转基因动物：采用基因工程技术，通过受精卵或早期胚胎细胞的基因转移，将外源基因与动物染色体结合，在动物体内得以表达并稳定的遗传给后代的一类动物。第49页/共91页51（二）生物制药动物药厂：通过转基因动物生产感兴趣的基因　　　把YFG放在β-乳球蛋白启动子下　　　　↓注入羊卵细胞→植入借腹怀孕母羊　　↓YFG在乳腺中表达　　↓乳汁中提纯YFG蛋白利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界的一项重大产业；已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态；2000年我国基因工程药物和疫苗年销售额已达近20亿元。﹡YFG：“你所宠爱的基因”(yourfavoritegene)第50页/共91页52（二）生物制药英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊，羊乳汁中含有能够治疗囊性纤维变性的人YFG蛋白。囊性纤维变性：第51页/共91页重组DNA医药产品预防霍乱口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防乙肝乙肝疫苗(CHO，酵母)利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗单克隆抗体抗组织损伤超氧化物歧化酶激活、剌激各类白细胞白细胞介素抗病毒感染及某些肿瘤干扰素(1b，2a，2b，)治疗糖尿病胰岛素治疗侏儒症生长素刺激细胞生长与分化生长因子(bFGF，EGF)剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子促进凝血血液因子VIII抗凝组织胞浆素原激活剂功能产品第52页/共91页54是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传病所涉及的基因置换、缺失或插入等突变，又称DNA诊断。（三）基因诊断(geneticdiagnosis)基本过程：区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断第53页/共91页55基因诊断的特点：①针对性强：以基因作为检查材料和探查对象，属于病因诊断②特异性高：以分子杂交为基本原理，选用特定的基因序列为探针③诊断灵敏度高：pg水平，多种检测技术均有放大效应④适应性强、诊断范围广⑤早期诊断：往往在疾病出现前，或者患儿出生前就可确定（三）基因诊断(geneticdiagnosis)第54页/共91页56美国前副总统Humphrey，1967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞，诊断为良性“慢性增生性囊肿”，未行手术治疗。九年后，诊断为“膀胱癌”，两年后死于该病。尿样：p53突变!（三）基因诊断(geneticdiagnosis)第55页/共91页57（四）基因治疗(genetherapy)1．定义：基因治疗是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。体细胞基因治疗(somaticcellgenetherapy)性细胞基因治疗(germlinegenetherapy)2．方式：第56页/共91页581990年，第一例腺苷脱氨酶缺陷患者治疗成功。遗传病、恶性肿瘤、心脑血管病以及病毒感染性疾病等疑难病的基因治疗方面进行了大量实验研究。如将固氮基因引入水稻，就不用再施氮肥第57页/共91页591.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性（五）遗传疾病的预防第58页/共91页60基因重组与基因工程：DNA的重组：重组DNA技术：重组DNA技术与医学的关系：同源重组：最基本细菌的重组：接合、转化、转导、细胞融合特异位点重组：整合酶转座重组：插入序列、转座子相关概念：工具酶、基因载体等原理步骤：分、切、接、转、筛（表）目的基因的获取重组体的连接筛选克隆基因的表达第59页/共91页61本章重点：基因重组，转化，转导，特异位点重组，转座重组，基因工程，重组DNA，DNA克隆，限制性核酸内切酶，基因载体重组DNA技术的基本原理及操作步骤获得目的基因的方法外源基因与载体的连接方法重组体的筛选方法第60页/共91页62复习第61页/共91页63蛋白质的生物学功能有哪些？蛋白质的基本结构单位是什么？有多少种？氨基酸是如何分类的？氨基酸的理化性质：两性解离、紫外吸收、茚三酮反应概念：肽键蛋白质结构与功能（1）第62页/共91页64蛋白质一、二、三、四级结构的定义、维系稳定的化学键蛋白质二级结构的形式、主要特点及影响因素概念：肽平面、模体、结构域蛋白质结构与功能（2）第63页/共91页65举例 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 蛋白质结构与功能的关系。简述蛋白质溶液维持稳定的因素。引起蛋白质变性的因素有哪些?变性蛋白质有何变化？概念：蛋白质等电点、蛋白质变性蛋白质结构与功能（3）第64页/共91页66DNA与RNA在化学组成上的区别DNA二级双螺旋结构的要点核酸结构与功能比较DNA和RNA在组成、结构、功能上的不同试述mRNA、tRNA、rRNA的结构特点和功能名词：帽子结构、核酶、DNA变性、增色效应、核酸分子杂交第65页/共91页67酶的概念酶的分子组成名词：酶的活性中心、必需基团、同工酶酶促反应的特点思考为什么酶能更有效地降低反应的活化能？酶（1）第66页/共91页68酶（2）影响酶促反应速度的因素米－曼氏方程式；曲线特点Km的大小、意义、双倒数作图求Km磺胺药抑菌的基本原理可逆性抑制的类型及特点第67页/共91页69酶的调节方式有哪些？酶分为几类？概念：变构调节、共价修饰调节、酶原的激活、酶活性思考酶与医学的关系。酶（3）第68页/共91页70糖酵解代谢小结（1）概念：在缺氧条件下，葡萄糖或糖原分解为乳酸的过程称为糖酵解。反应部位：胞浆三个关键酶催化三步不可逆反应产能的方式和数量方式：底物水平磷酸化净生成ATP数量：从G开始2×2-2=2ATP从Gn开始2×2-1=3ATP意义缺氧时迅速提供能量；为红细胞及代谢活跃组织提供能量。第69页/共91页71糖有氧氧化的概念反应部位三个阶段的关键酶三羧酸循环的要点、意义糖有氧氧化的意义及ATP的计算糖有氧氧化小结（2）1分子3-磷酸甘油醛彻底氧化后产生几分子ATP？第70页/共91页72小结（3）磷酸戊糖途径的限速酶、主要产物、意义糖原合成与分解的概念、代谢器官、关键酶、意义糖原合成与分解调节的特点乳酸循环糖异生的概念、器官、原料、关键酶、意义血糖的来源和去路④胰岛素、胰高血糖素调节血糖的机制小结（4）第71页/共91页73脂类代谢小结（1）1、脂类的种类及功能；必需脂酸2、脂肪动员的概念、限速酶、产物3、脂酸氧化分解的过程、限速酶；脂酸β氧化的步骤、直接产物4、软脂酸彻底氧化产生ATP的计算第72页/共91页74小结（2）1、酮体的组成；合成的部位、原料、关键酶；酮体生成的意义。2、脂酸合成的部位、原料、关键酶；3、脂肪合成的部位、原料、两种途径第73页/共91页75小结（3）1、磷脂的种类、合成原料、功能2、胆固醇合成的部位、原料、限速酶3、胆固醇的功能及代谢去路乙酰辅酶A的来源和去路有那些？3-磷酸甘油的来源和去路有那些？第74页/共91页76小结（4）1、血浆脂蛋白的分类2、载脂蛋白的概念、功能3、血浆脂蛋白的合成部位、组成特点及功能简述糖代谢和脂类代谢的联系第75页/共91页77小结1.生物氧化的概念、生理意义。2.呼吸链的概念、组成成分；两条呼吸链的排列顺序。3.底物水平磷酸化、P/O的概念。4.氧化磷酸化的概念、偶联部位。5.NADH两种穿梭途径。第76页/共91页78氨基酸代谢1、氮平衡、必需氨基酸、氨基酸代谢库2、氨基酸的脱氨基作用（类型）3、血氨的来源、去路；转运形式4、尿素的合成（器官、原料、酶）5、一碳单位（概念、载体、生理意义）第77页/共91页791、嘌呤、嘧啶核苷酸从头合成的原料、；分解产物；2、脱氧核苷酸的生成。核苷酸代谢（出题较少）第78页/共91页80肝的生物化学①肝脏在物质代谢中的作用②生物转化的概念、主要器官、意义及生物转化反应的主要类型。③胆汁酸的肠肝循环及生理意义。④胆红素的生成、运输、肝脏转化、肠道转变和胆素原的肠肝循环；三种黄疸的胆色素代谢异常的特点第79页/共91页81复制小结（1）DNA复制的基本规律：3个参与DNA复制的物质：模板、底物、酶、引物、其他蛋白因子名词：半保留复制、双向复制、复制叉、复制子、半不连续复制、领头链、随从链、冈崎片段、Klenow片段思考题1、试述参与DNA复制的物质及其作用。2、原核与真核DNA聚合酶的比较。3、思考生物维持遗传信息稳定的机制。第80页/共91页82小结（2）原核DNA复制起始、延长、终止过程的主要事件真核DNA复制的主要特点名词：引发体、端粒酶思考题1、简述原核DNA复制的过程。2、真核DNA复制与原核的不同之处？(起点、酶、复制因子、引物及冈崎片段长度、切除引物、末端复制、核小体装配、时序性）第81页/共91页83小结（3）名词：逆转录、cDNA、滚环复制、D环复制、切除修复逆转录发现的意义DNA突变的生物学意义、类型；DNA损伤的修复类型第82页/共91页84转录小结（1）1、概念：不对称转录、模板链、编码链、启动子、因子、转录空泡2、原核RNA聚合酶的亚基组成及功能3、原核生物转录的过程：起始、延长、终止思考题1、试比较复制与转录的异同点。2、简述原核生物的转录过程。第83页/共91页85小结（2）1、真核RNA聚合酶的种类、特点2、真核生物基因转录的特点3、真核3种RNA加工的主要特点4、概念：帽子结构、断裂基因、外显子、内含子思考题试比较原核与真核生物转录的区别。第84页/共91页861、蛋白质生物合成体系的成分2、遗传密码的特点：方向性、连续性、兼并性、通用性、摆动性3、氨基酸活化的概念、催化的酶4、名词：氨基酸活化、开放阅读框架、密码子、简并性、摆动性翻译小结（1）思考题试述mRNA、tRNA、rRNA在蛋白质合成中的作用。第85页/共91页87小结（2）原核肽链合成过程：起始：4步，形成翻译起始复合物(核糖体-mRNA-fMet-tRNA)延长：进位、成肽、转位(延长1个肽键、4个高能磷酸键）终止：释放肽链；mRNA、tRNA离开核糖体2.真核肽链合成的特点3.名词：SD序列、核糖体循环、多聚核糖体思考题：1、比较原核、真核生物翻译过程的不同2、维持肽链合成高度准确的机制？氨基酰tRNA合成酶的特异性及校正活性、反密码子与密码子的互补、核糖体对进位的校正作用第86页/共91页88小结名词：分子伴侣、信号序列、信号肽、蛋白质靶向输送翻译后修饰的形式及意义不同抗生素抑制翻译的位点思考题：1.信号序列的种类和作用。2.哪些物质可以抑制蛋白质的合成？第87页/共91页89基因表达调控小结（1）1、基因表达调控的特点、方式和意义。2、参与基因表达调控的基本因素3、原核基因转录调节的特点（3个）4、乳糖操纵子的结构及调控机制5、概念：操纵子、顺式作用元件、反式作用因子第88页/共91页90小结（2）1、真核基因组的结构特点（庞大、单顺反子、重复序列、不连续性）2、真核基因转录调控的特点（3种RNApol、染色质变化、正性调节、转录与翻译分隔、修饰加工）3、概念：单顺反子、增强子、miRNA、siRNA、RNA干涉第89页/共91页91祝同学们考试顺利！新年愉快！第90页/共91页