地塞米松诱导体外培养星型胶质细胞凋亡机制的研究

地塞米松诱导体外造就星型胶质细胞凋亡机制的研究　　金红艳欧阳铭戴冀斌　　【关键词】地塞米松；星型胶质细胞；凋亡；P53；Bax；Bl2　　摘要：目的：探究地塞米松引起体外纯化造就的大鼠大脑皮质星型胶质细胞凋亡的机制。要领：差异浓度的地塞米松〔浓度为10-5、10-4、10-3l/L〕与纯化造就的大鼠大脑皮质星形胶质细胞配合孵育24小时后，用免疫细胞化学要领检测P53、Bax及Bl2在星型胶质细胞内的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达环境，表达的强弱用均匀光密度表现。效果：P53和Bax的表达随着地塞米松浓度的升高而加强，与比较组比力，各组均有极明显性差异〔P0.01〕,Bl2的表达随着地塞米松浓度的升高先是加强此后削弱，与其他组比力10-3组有明显性差异〔P0.05〕。结论：P53和Bax的表达加强大概是大剂量地塞米松引起星型胶质细胞凋亡的重要因素。　　关键词：地塞米松；星型胶质细胞；凋亡；P53；Bax；Bl2　　在哺乳动物的中枢神经体系内约有一千亿个神经元，而在这些神经元的四周又约有十倍以上的胶质细胞存在，此中以星型胶质细胞数目最多。传统不雅点以为，星型胶质细胞只对神经元起布局和成效上的支持作用，但比年来越来越多的证据表白，星型胶质细胞在中枢神经体系内饰演着更为积极和更为紧张的脚色，这也是胶质细胞成为神经范畴研究热门的一个直接缘故原由。糖皮质激素(glurtiid,G)是一类具有神经活性的甾体激素，已有很多实行 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 G对神经元的生长、分化和凋亡都起紧张的调治作用，但对胶质细胞的影响报道不多。已有报道证明大剂量的地塞米松可诱导体外造就的星型胶质细胞凋亡［1］，为进一步探究其机制，我们做了如下研究。　　1质料和要领　　11质料　　新生istar大鼠6只〔由华中科技大学同济医学院实行动物中心提供〕；DE/F12造就基〔GIB公司〕；胎牛血清和小牛血清〔GIB公司〕；L谷氨酰胺〔上海伯奥生物科技〕；地塞米松〔湖北恒生制药〕；兔抗p53、Bax、Bl2抗体〔santaruz公司〕；SAB免疫组化试剂盒及DAB试剂盒〔北京中山公司〕；24孔造就板〔rning公司〕；HPIAS1000高清楚度彩色病理图文陈诉阐发体系〔同济千屏影像公司〕；SL2300二氧化碳造就箱〔美国Sheldn公司〕；UFXII光学显微镜〔日本Nikn公司〕。　　12要领　　121星形胶质细胞的纯化造就将出生1~2天的新生istar大鼠用75%的酒精浸泡消毒后，接纳无菌要领敏捷取出大脑，用DHanks液洗濯并剔除脑膜和血管，取大脑皮质，将构造剪碎为13巨细，用0.125%胰卵白酶37℃消化数分钟，过滤〔200目〕，离心〔1000rp5in〕，去上清，参加DE/F12完全造就基〔此中含5%胎牛血清，10%小牛血清，L谷氨酰胺2l/L，青霉素100u/l,链霉素0.1g/l〕制成细胞悬液。计数后按5×104/2接种于造就瓶，参加DE/F12完全造就基，在37℃、5%2造就箱中造就9天〔每3天调换造就液一次〕，第9天将造就瓶置于恒温旋转摇床上(240rp)，摇18小时，去掉含有悬浮细胞的造就液，用DHanks液洗濯3次，举行传代造就即得纯化的星形胶质细胞［2］。经免疫细胞化学要领检测，95%以上的细胞GFAP免疫反响为阳性。　　122实行分组在24孔造就板的每一孔内放入一张12消毒过的玻片，涂上多聚赖氨酸，然后将星型胶质细胞分组种在玻片上〔细胞爬片〕。纯化的星形胶质细胞被分成1个比较组和3个实行组，每组3个样本。比较组不加地塞米松，别的3组别离参加终浓度为10-5、10-4、10-3l/L的地塞米松。在37℃、5%2条件下，继承造就24小时,然后作免疫细胞化学阐发。　　123免疫细胞化学染色将各组细胞爬片举行SAB法免疫细胞化学染色。每一造就孔中的细胞爬片经结实、关闭非特异性抗原和消除内源性过氧化物酶等处置惩罚后，起首参加特异性抗体〔P53、Bax、Bl2〕，4℃孵育72h。然后依次参加生物素化羊抗兔IgG，37℃、1h；SAB复合物，37℃、1h；DAB显色5in。每步间均用PBS充实洗涤。全部爬片经脱水、透明、中性树胶封片后，光镜下不雅察、摄片。　　以正常兔血清和PBS缓冲液交换一抗作比较染色，效果为阴性。　　124图像阐发用HPIAS1000高清楚图像阐发体系举行阳性细胞计数及均匀光密度阐发。所得数据应用SPSS统计软件，以方差阐发举行统计阐发，P＜0.05定为差异有明显性,数据以均数±尺度差〔±s〕表现。　　2效果　　21形态学不雅测效果　　P53比较组：可见少数免疫反响阳性细胞，反响产物呈棕黄色，重要见于胞核〔图1〕。10-5组：免疫反响阳性细胞增多，反响产物呈棕黄色，见于胞核，胞浆淡染〔图2〕。10-4组：免疫反响阳性细胞显着增多，反响产物呈棕黄色，见于胞核，胞浆也有表达〔图3〕。10-3组：大多数细胞呈免疫反响阳性，反响产物呈棕褐色，胞核胞浆边界不清〔图4〕。　　Bax比较组：细胞巨细形态同等，核膜着色呈棕黄色，胞核中心有透亮区，胞浆淡染〔图5〕。10-5组：免疫反响产物颜色加深，细胞形态变革不大〔图6〕。10-4组：颜色进一步加深，细胞形态无太大变革〔图7〕。10-3组：免疫反响产物呈棕褐色，胞浆染色显着加深，少数细胞体积缩小，核浓缩、深染〔图8〕。　　Bl2比较组、10-5组、10-4组这3组细胞巨细形态根本同等，细胞着色变革也不大，胞核胞浆均有着色，反响产物呈棕黄色〔图9~11〕。10-3组：与前3组比力，10-3组细胞染色显着变浅，尤其是胞浆显着淡染〔图12〕。图1比较组P53的表达(×200)图210-5组P53的表达(×200)　　22图像阐发效果　　221地塞米松对P53表达的影响差异浓度〔比较组、10-5组、10-4组、10-3组〕地塞米松与纯化的星型胶质细胞配合孵育24小时后，P53的表达随着地塞米松浓度的升高而渐渐加强，与比较组比力各组均有极明显性差异〔P0.01〕，各浓度组〔10-5组、10-4组、10-3组〕之间两两比力也有极明显性差异〔P0.01〕，见表1。　　222地塞米松对Bax表达的影响差异浓度〔比较组、10-5组、10-4组、10-3组〕的地塞米松与纯化的星型胶质细胞配合孵育24小时后，Bax的表达也随着地塞米松浓度的升高而加强，但其幅度有所减缓，与比较组比力各组均有极明显性差异〔P0.01〕，各浓度组〔10-5组、10-4组、10-3组〕之间两两比力有明显性差异〔P0.05〕,见表1。　　223地塞米松对Bl2表达的影响差异浓度〔比较组、10-5组、10-4组、10-3组〕的地塞米松与纯化的星型胶质细胞配合孵育24小时后，Bl2的表达变革较庞大，先是10-5组出现加强趋势，从10-4组开始出现削弱趋势，至10-3组出现显着削弱，此中比较组、10-5组、10-4组之间颠末统计学阐发没有明显性差异〔P0.05〕,而10-3组与其他各组比力有明显性差异〔P0.05〕,见表1。表1星型胶质细胞经Dex处置惩罚后P53、Bax、Bl2表达的均匀光密度　　224地塞米松对Bax与Bl2表达比值〔Bax/Bl2〕的影响把每一浓度组Bax表达的均匀光密度与同组Bl2的均匀光密度作一比值，我们创造随着地塞米松浓度的升高，Bax/Bl2值也渐渐升高，而10-3组最为明显，见表2。表2星型胶质细胞经Dex处置惩罚后Bax与Bl2均匀光密度比值　　3讨论　　细胞凋亡〔步伐化细胞殒命〕与细胞坏死完全差异，它是一种积极意义上的细胞殒命，它不单在病理条件下并且在多种生理条件下发挥着紧张的作用［3,4］。有大量证据表白，在胚胎发育历程中产生的神经细胞的殒命大多与凋亡有关［5］。别的，局部缺血、快乐毒性作用、脑外伤和慢性退行性病变等都可促使凋亡的产生［4,6］。已有报道证明，大剂量的地塞米松可引起体外纯化造就的星型胶质细胞凋亡［1］，但其确切机制尚不清楚。为了探究此中的机制，我们 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 了本实行，查验地塞米松是否引起了P53、Bax及Bl2表达的变革。我们创造，P53的表达随着地塞米松浓度的升高而渐渐加强，Bax的表达也随着地塞米松浓度的升高而加强，但其幅度有所减缓，Bl2的表达先是10-5组出现加强趋势，从10-4组开始出现削弱趋势，至10-3组出现显着削弱，如许导致Bax/Bl2值渐渐升高，10-3组最为显着，这大概是10-3组引起星型胶质细胞凋亡的直接缘故原由。　　众所周知，很多缘故原由好比缺血、放射线以及快乐毒性作用都可以引起P53表达的加强，终极导致神经细胞凋亡［2，7］。P53基因编码的产物，即P53卵白可以调治Bax的表达，而Bax大概是介导P53依靠的神经细胞凋亡的重要因素［8］。别的，hiteetal创造在敲撤除Bax基因的小鼠大脑中很难寻到天然殒命的神经细胞［9］。有人创造P53可以通过低落Bl2的表达来间接地引起细胞凋亡［10］。Bax可以通过与Bl2形成同型或异型二聚体来促进凋亡的产生［11］，因此，Bax与Bl2比例的变革就可以决定某些细胞是存活或是殒命［11］。在本实行中，地塞米松引起P53连续升高，Bax也有雷同的表现，而Bl2是先升后落。总之，P53、Bax、Bl2颠末地塞米松作用后其表达都产生了明显的改变，尤其是10-3组，这提示它们在地塞米松诱导星型胶质细胞凋亡的历程中发挥着紧张的作用。Bax表达加强大概是P53表达加强的效果，由于P53可以促进Bax的转录和 翻译 阿房宫赋翻译下载德汉翻译pdf阿房宫赋翻译下载阿房宫赋翻译下载翻译理论.doc ［10］。另一方面，P53表达的加强又大概按捺了Bl2，使它表达落落［10］，但是细胞自己大概存在一种抗凋亡的赔偿机制［12］，使得在Bax表达加强的环境下Bl2也加强表达，以对抗Bax的促凋亡作用，但这种抗凋亡作用是有必然限度的，因此，Bl2的表达先加强后削弱。Bax/Bl2值因此举行性升高，这大概直接导致10-3组星型胶质细胞凋亡。　　参考文献　　1王珍，刘仁刚，周洁萍，等地塞米松诱导造就的大鼠大脑皮质星型胶质细胞凋亡.中国构造化学和细胞化学杂志，2002，11〔3〕：282~285　　4LEist,.andNitera,P.A 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