细胞工程学第

第七章植物细胞培养植物细胞培养是指在离体条件下培养植物细胞的方法。植物细胞与植物组织培养的区别是：植物组织培养是从机体内取出组织，模拟体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织和植株的一种方法。植物细胞培养是将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，使组织分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，获得大量的细胞群体。植物组织培养主要用于植物快速繁殖的组培技术。植物细胞培养主要是以生产植物次生代谢产物为目的的大规模细胞培养技术。第一节植物细胞培养概述植物细胞培养技术就是为了某种目的而在细胞水平上对离体植物细胞或原生质体进行的一系列生物工艺学操作。它包括分离、培养、再生以及一系列相关的操作。目的：主要是指在无菌条件下通过悬浮培养植物细胞生产有用化合物的过程。植物细胞培养是在植物组织培养技术的基础上发展起来的。1902年Haberlandt确定了植物的单个细胞内具有全能性，使成为植物组织培养的开端。1939年Gautheret、Nobercourt、White分别成功地培养了烟草、萝卜的细胞。20世纪50年代，Talecke和Nickell确立了植物细胞能够成功地生长在悬浮培养基中。1956年Nickell和Routin第一个申请用植物组织细胞培养产生化学物质的专利以来，应用细胞培养生产有用的次生物质的研究取得了很大的进展。1959年Tu1ecke和Nickell首次采用大体积〔20升)的硫酸瓶进行了蔷薇(Rosasp．)茎段的细胞大量培养。1967年Kaul和Staba采用多升发酵罐对小阿米(Ammivisnaga)进行了细胞大量培养的研究，并从细胞培养物中得到了第一个药用成分呋喃色酮(visnagin)。1972年，Kato培养烟草细胞以获得尼古丁，最后放大到在20000升的生物反应器上进行分批和连续培养，其生产能力为5．82kg／m3．d。1983年，日本三井石油化学工业公司利用大规模培养紫草细胞生产紫草宁，产物终浓度达1400mg／L；随后，Ushiyama等在20000升生物反应器中成功地进行了100公斤／月的人参愈伤组织培养。迄今为止，全世界已对近1000余种植物进行过细胞培养方面的研究，生产的天然产物包括药品、香料、色素、食品、化妆品等500多种。许多植物的细胞培养已完成实验室阶段研究，正向工厂中试过渡，有的已完成工厂化生产规模的实验。如人参、紫草、毛地黄、烟草、肉桂、迷迭香、黄芪等。将植物细胞培养用于无性繁殖，大大增加了无性繁殖的范围和潜力，细胞培养能够提高繁殖速度，一个优良品种，用细胞培养再分化植株的方法，在几个月内就能大面积种植，而常规的育种法需要好几年。通过植物细胞培养可以获得许多产品，但总的来说分为两类：初级代谢产物（包括细胞本身为产物）和次级代谢产物。大规模培养植物细胞主要用于生产次级代谢产物。有些产物通过化学方法合成很不经济；有些产物其唯一来源只能是植物细胞。第二节植物细胞培养的培养基一、植物细胞培养基的选择目前应用最广泛的基础培养基主要有MS、B5、E1、N6、NN和L2等。在培养的不同阶段采用不同培养基以促进细胞生长及其它目的，是十分重要的。培养基组成1、无机盐2、碳源3、植物生长素4、有机氮源5、有机酸6、复合物质二、植物细胞培养基的分类培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个集落。三、植物细胞培养基的组成无论培养目标 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 是针对细胞生长还是针对代谢产物的积累，其培养基主要由碳源、有机氮源、无机盐、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。四、植物细胞培养基的制备培养基中使用的无机盐、碳源、维生素和生长激素应该采用高纯度级的药品。由于培养基配比中有些组分量很小，种类又很多，配制起来很繁琐。因此往往把培养基配成使用浓度的10倍或者100倍的母液，分成小瓶后冷冻保存，使用时再稀释到正常浓度。第三节植物细胞培养的方法细胞培养固体培养液体培养琼脂固体化摇瓶反应器培养培养悬浮培养大规模培养分批培养半连续培养连续培养恒化培养恒浊培养一、细胞培养条件温度：培养温度对植物细胞生长及次生代谢产物生成有重要影响。通常，植物细胞培养采用25℃。搅拌：在摇瓶实验中，通常摇床的转速取90—120r／min。pH值：通过细胞膜进行的H+离子传递对细胞的生育环境、生理活性来说无疑是重要的。在培养过程中，通常pH作为一个重要参数被控制在一定范围内。植物细胞培养的适宜pH值一般为5—6。通气：通气是细胞液体深层培养重要的物理化学因子。好气培养系统的通气与混合及搅拌是相互关联的。对摇瓶试验，通常500m1的三角瓶内装80—200m1的植物细胞培养液较适宜。光：光对植物有着特殊的作用。光照射条件不仅通过光照周期、光的质量而且通过光照量的调节来影响植物细胞的生理特性和培养特性。研究表明，光调节着细胞中的关键酶的活性，有时光能大大促进代谢产物的生成，有时却起着阻害作用。细胞龄：在培养过程的不同时期，细胞的生理状况、生长与物质生产能力差异显著。而且，使用不同细胞龄的种细胞，其后代的生长与物质生产状况也会大不一样。通常，使用处于对数生长期后期或稳定期前期的细胞作为接种细胞较合适。接种量：在植物细胞培养中，接种量也是一个影响因素。在再次培养中，往往取前次培养液的5—20％作为种液，也可以接种细胞湿重为基准，其接种浓度为15—50g(湿细胞)／L。由于接种量对细胞产率及二次代谢物质的生产有一定影响，故应根据不同的培养对象通过试验，确定其最大接种量。二、细胞培养的技术方法①细胞悬浮培养法：把离体植物细胞悬浮在液体培养基中进行无菌培养。能通过激素及营养调节来加快细胞生长速度及提高次生物质含量。②两相培养技术：细胞在水相中生长并分泌次生物质，次生物质可以转移吸附到有机相中，能减少产物的反馈抑制使产物含量提高。③反义技术：次生代谢是多条途径的，可调节的。将反义DNA或RNA片段引入植物细胞，使催化某一分支代谢的关键酶的活性受到抑制或者增强，配合添加一些前体物质可提高目的化合物的产量。三、存在的问题(1)植物细胞个体大，直径一般20—150um，比细菌和真菌大10—100倍，不耐剪切，且在反应中常以聚集体形式出现。(2)接种量大，一般10—30％，有的高达50％，这样制备足够量的种子成本花费太大。(3)植物细胞收获量与种细胞量成比例地增加，但是目的产物含有率却随种细胞量增加出现峰值。因此接种量又不能太大，否则难以达到培养液的高细胞密度。(4)植物细胞培养目的产物量一般很低，收率低，难提取。提纯分离费用占总成本费50一60％。(5)植物细胞遗传稳定性差，新生代与母代细胞染色体和遗传性常发生突变。反应器四、单细胞制备方法1、机械法2、酶法3、愈伤组织诱导法五、单细胞培养方法1、平板培养法（1）单细胞悬浮液的制备，并计数。（2）调节细胞密度。（3）培养基选择与凝固基选择，浇平板。（4）接种培养。2、看护培养与饲养层培养法看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。优点：简便、成功率高。缺点：不能在显微镜下直接观察。3、液体浅层静置培养法优点：易于补加新鲜培养基、可以镜检。4、细胞悬浮培养法优点：（1）能大量提供比较均匀的细胞。（2）细胞营养吸收、环境条件好，细胞增殖快。（3）适合大规模培养，生产有价值的活性代谢产物。六、细胞的保存1、继代培养保存法2、低温保存法-20度保存3、冰冻保存液氮保存七、细胞培养技术的优点1、代谢产物的生产是在控制条件下进行的。不仅节约能源，减少耕地占用面积，降低成本，而且不受地理、季节、地域和气候条件的限制。生产周期短，可大大提高经济效益。2、细胞培养是在无菌条件下进行的，可以排除病菌和害虫的影响。可代替整体植株在工厂内连续生产所需产物。3、可通过添加抑制剂等使生物合成按照人们的设计进行；可以通过特定的生物转化途径获得均一的有效成分。4、可通过诱变筛选，获得高产细胞株，可以探索新的合成路线，并且可以进行特定的生物转化获得新的有用物质。八、植物细胞培养的意义1、药用代谢产物2、天然食品、食品添加剂3、杀虫剂、杀菌剂4、饲料、精细化工等产品第四节植物原生质体培养一、原生质体的定义植物细胞与动物细胞相比具有一层细胞壁，当将细胞壁除去后就可以得到裸露的球形细胞，称为原生质体。二、原生质体的特点1、无细胞壁障碍，可以方便地进行有关遗传操作，并可以对膜、细胞器等进行基础研究。2、具有全能性，并能进行人工培养发育成完整植株。3、原生质体适合进行诱导融合形成杂种细胞。三、原生质体的用途1、提供相关生理生化研究的 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 2、利用原生质体摄取诸如病毒、细菌、细胞器、蛋白质、核酸等外源物质的特点而被用作研究基因调控和表达、遗传工程的材料。3、进行原生质体融合，改变遗传物质，建立杂交品种，还可以用于研究染色体行为、基因定位等。4、用于细胞器的分离，或进行相关细胞器的遗传实验。四、原生质体的分离1、机械法。2、酶解法。例如：琼脂酶、果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等。酶解法具有条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高等优点。五、原生质体纯化1、过滤-离心法2、漂浮法25%的蔗糖溶液3、沉降法和漂浮法结合六、原生质体活力测定1、染色法（1）二乙酸荧光素（FDA）法（2）酚藏花红染料法（3）伊文思蓝染色法2、胞质环流法3、渗透压变化4、氧电极法七、原生质体培养1、液体培养法2、固体培养法3、双层培养法八、原生质体的发育和植株再生1、细胞壁再生2、分裂3、愈伤组织或胚状体的形成4、植株再生九、原生质体分离与培养的意义1、融合产生体细胞杂种。2、分离或引入各种细胞器。3、导入外源基因。4、诱发突变体。5、研究细胞信息传递、能量转换、物质运输等。6、研究细胞壁合成机制。7、研究膜的功能与细胞膜相互的作用。8、研究核质关系。9、研究疾病与抗性机理。第五节人工种子简介一、人工种子概念人工种子是指通过植物组织培养技术获得具有胚芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体，并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。这就是人工种子为什么要研究人工种子？1、在长期的遗传与变异中，有些种子在慢慢失去结出丰硕果实的能力。它们的种子退化，自然繁殖能力减退，久而久之，这些植物就变成了珍稀濒危物种，面临从地球上消失的危险。2、如何有效地拯救这些珍稀物种，开发它们的药用价值等，已成为植物科学研究的热门课题。即用人工种子的方法来解决这个问题。二、人工种子的构成天然种子的构造胚：由胚芽、胚轴、胚根和子叶构成，将来发育成植株胚乳：含大量营养物质，是种苗萌发生长不可缺少的营养来源种皮：在种子外层起保护作用人工种子的构造：1、胚状体（体细胞胚）2、人工胚乳3、人工种皮胚状体胚状体不同于一般的种子胚种子胚是由该植物雌雄配子融合后形成的合子细胞进一步分化形成的，是种子的生命所在。而胚状体是由非合子细胞分化形成的类似于胚的结构物，所以又称体细胞胚。人工胚乳人工胚乳是人工配置的保证胚状体生长发育需要的营养物质，一般以生成胚状体的培养基为主，外加一定量的植物激素、抗生素、CaCl2、活性炭、防腐剂、除草剂等物质，尽可能提供胚状体正常萌发所需条件。人工种皮人工种皮指包裹在最外层的胶质化合物薄膜，要求其能够允许内外气体交换畅通，防止人工胚乳中的水分和各种营养物质的渗漏，并具有一定的机械抗压性。人工种皮上没有种脐、种孔等结构。三、人工种子的制造过程1、培养大量体细胞胚（1）要求人工种子体细胞胚与天然种子有相当的成株率甚至超过天然种子，因此培养出高质量的体细胞胚是制备人工种子最重要的技术关键。（2）掌握影响胚状体发生和发育的条件：植物激素、氮素、氨基酸、天然提取物、活性炭等。（3）要控制胚状体的同步生长：先使DNA合成停止,抑制细胞分裂,再使细胞进入同步分裂。2、人工胚乳的制作体细胞胚的包裹关系到人工种子的萌发和生产应用成败。包裹物要不影响体细胞胚的萌发，并提供其萌发与成苗所需的养分和能量，即起到胚乳的作用。人工胚乳的制作人工胚乳提供胚状体新陈代谢和生长发育的营养物质及生长素等。人工胚乳的制作实质上是筛选出适合该体细胞胚萌发的培养基配方,最后将筛选出的培养基添加到包埋介质中。人工胚乳的培养基人工胚乳的培养基中应该有这种植物生长发育所必需的营养物质、生长发育控制因子及其他化学或生物因子，以满足体细胞胚能顺利发展成植物的全部需要，此外还需加适当的杀虫剂和杀菌剂，因为人工种子种植、发芽或发育过程中可能比自然种子更易受霉菌、细菌、害虫的侵染。包埋介质的选择1、要是能起缓冲作用的亲水胶体，但同时又是在体细胞胚发芽时能穿透的物质。2、应有足够的硬度以保证人工种子在生产、运输和种植过程中的安全，同时又要保持人工种子良好的生活力和发芽率。用海藻酸钠可作包埋介质的基本成分（人工胚乳）：将成熟的健康体细胞胚与2%-3%的海藻酸钠混合（混合前海藻酸钠已加入必要成分），然后将含一个个体细胞胚的海藻酸钠小滴一一加到适当浓度的CaCl2中，经胶复合作用的造型过程，便可在20-30分钟左右形成形似鱼肝油丸大小的有一定硬度的成型雏形人工种子。3、装配人工种皮人工种皮的要求：1、有一定密闭性，以保持人工胚乳的各种成分不易流失，又要有适当的透气性，以利于气体的交流。2、既要有一定的坚硬度，起到对体细胞胚的保护作用，加强其耐储力和对各种机械作用的抵抗力，以利于储存、运输，又要在人工种子萌发时，能让体细胞胚顺利发芽，也就是要软硬适中。3、人工种皮本身应对体细胞胚及幼苗无毒，最好兼有一定的杀伤病虫害的作用，还要求装配简单，成本也不宜太高。人工种子的制造程序大致包括：1、外植体的选择和消毒；2、愈伤组织的诱导；3、体细胞胚的诱导；4、体细胞胚的同步化；5、体细胞胚的分选；6、体细胞胚的包裹(人工胚乳)；7、包裹外膜（人工种皮）；8、发芽成苗试验；9、体细胞胚变异程度与农艺研究。四、人工种子的优点1、繁殖速度快2、遗传变异问题少3、大大缩短育种周期，加速良种繁育速度4、具备一些天然种子不具备的功能5、便于贮存和运输，适合机械化播种4．可获得含有特种宝贵基因的植株。5．可人为地影响控制作物生长发育和抗性。6．节约粮食。7．可以保存及快速繁殖脱病毒苗。8．体积小，占用空间小，不受环境因素制约，可一年四季进行人工种子工厂化生产。