第三章 基因工程载体

第三章基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 载体vectors定义：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。1.载体（Vectors）多克隆位点(multiplecloningsite)ori复制起始点遗传标记pUCMCSAmpr（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。（3）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。2.基因工程对载体的要求（7）具有较好的安全性，不能任意转移。（2）有选择性标记Ampr、Tetr、Kanr等。（4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。（5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。（6）具有对受体细胞的可转移性。载体的种类基因工程中常用的载体有5类：质粒（plasmid）单链DNA噬菌体M13噬菌体的衍生物柯斯质粒（cosmid）动物病毒（virus）第一节质粒载体一、质粒（plasmid）独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子（CovalentlyClosedCircularDNA,cccDNA）。并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细胞某些抵御外界环境因素不利影响的能力，如抗生素抗性、对重金属离子的抗性、分泌细菌毒素等。分子量在1-500kb之间广泛存在于细菌。5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件三、质粒载体的构建1、质粒构建基本策略1.加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选择转化体2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组3.缩短长度，提高导入效率，增加装载量4.改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝1.pBR322：p:质粒；BR：质粒两位主要构建者姓氏的第一个字母；322：实验编号人工构建载体三个亲本质粒：pMB1:出发质粒(ColE1)pSF2124:AmprpSC101:TetrpSF2124pMB1pSC101四、经典的大肠杆菌质粒载体氨苄青霉素和四环素抗性24个单一克隆位点。9个导致Tetr基因失活3个会导致Ampr基因失活氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copies③安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。②高拷贝数①分子小，克隆能力大长度4363bp，易于纯化，可以携带6-8Kb的外源DNA片段。④具有较多的单一酶切位点（24种）4、pUC质粒载体1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的结构：（1）来自于pBR322的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。但核苷酸序列发生了变化（3）LacZ′基因编码β—半乳糖酶的α—肽链（4）MCS区段（MCS）区段位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点。但它并不破坏该基因的功能。与pBR322相比，pUC质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数如pUC8为2750bp，pUCl8为2686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体通过-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。（3）具有多克隆位点区段（MCS）适合不同粘性末端的DNA片段插入，不必连接接头释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别，如果LacZ’插入外源基因被破坏，菌落则是白色的。组织化学法检测重组体X-Gal-半乳糖苷酶IPTG诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷半乳糖5-溴-4-氯-靛蓝＋第二节噬菌体载体组成：蛋白质、核酸.结构：蛋白质外壳、尾巴尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。是比细菌还小得多的微生物，噬菌体侵犯细菌，可以认为它是细菌里的“寄生虫”。Bacteriophage(phage)一、大肠杆菌的λ-噬菌体DNA（1）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链（粘性末端，cohesive-endsite），称λcossite，粘性末端粘连接变成环状DNA。（一）λ-噬菌体的生物学特性1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成λcos位点是噬菌体包装必需序列。2、λ-DNA的物理图谱48.5kb（2）功能相近的基因在基因组中聚集在一起目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需基因（二）λ噬菌体载体的构建1.选用λ噬菌体作为构建克隆载体材料的依据是一种温和噬菌体。能承载比较大的外源DNA片段λDNA分子上有多种限制酶的识别位点2.构建λ噬菌体克隆载体的技术路线用限制酶切去λDNA上的非必需区在λDNA上非必需区内插入选择标记基因建立λDNA分子体外包装系统（1）插入式载体只具有一个可供外源DNA插入的限制酶位点的λ噬菌体。常用：λgt10、λNM1149等载体.（2）置换型载体（取代型载体）具有成对的限制酶位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。常用：EMBL3、EMBL4二.λ噬菌体载体的主要类型三、λ-DNA作为载体的优点可在体外包装成噬菌体颗粒，高效转染大肠杆菌λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量重组。λ-DNA分子的筛选较为方便。λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，常用于构建基因文库缺点：(1)需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用又高；(2)没有质粒的用途广泛。第三节、人工染色体克隆载体基本元件：含有质粒克隆载体所必需的第一受体（大肠杆菌）的质粒复制起始点；第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列.合适的选择标记基因。利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。酵母人工染色体（YAC）细菌人工染色体（BAC）（一）酵母人工染色体（YAC）把酵母染色体与基因复制和 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母chr的转录功能和复制功能。装载量为350-400kb含有的元件：酵母自主复制序列(ARS)着丝粒序列(cen)四膜虫端粒（tel）质粒选择标记酵母系统的选择标记质粒复制起点一、YAC的基本序列元件酵母染色体DNA自主复制序列（ARS）酵母染色体的着丝粒序列（CEN）酵母染色体的端粒序列（TEL）酵母人工染色体（YAC）YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。酵母自主复制序列（ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必需的信号。酵母着丝点(CEN)在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。pYAC4：酵母第四条染色体的着丝粒。正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel）定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，形成稳定的结构。二、 YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因TRP1：色氨酸生物合成基因缺陷型URA3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型LEU2：亮氨酸合成基因缺陷型SUP4：赭石突变抑制基因克隆位点：位于sup4基因内SuP4是一个赭石突变（UAA）抑制基因。宿主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2。在赭石突变宿主中，没有外源基因插入时，sup4基因抑制赭石突变，则形成正常白色菌落；有外源基因插入时，sup4基因遭破坏，则形成红色菌落，十分容易挑选出有DNA插入片段的红色菌落，建成YAC文库。YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因在限制性内切酶酶解后变成大片段DNA，克隆进酵母载体DNA，转染酵母缩主细胞，扩增后，根据标记性状筛选出重组的人工染色体。三、克隆策略酵母人工染色体的使用四、酵母人工染色体（YAC）缺点首先，在YAC载体的插入片段会出现缺失和基因重排的现象。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的插入片段由2个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的5%～50%。第三，YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，就很难从中分离出来，影响了YAC载体的广泛应用。（二）细菌人工染色体（BAC）1992年Shizuya利用F因子的复制起点和氯霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131）基础上构建了第一代BAC人工染色体。能够克隆和保持大于100kb的DNA。用于：克隆大型基因簇结构构建动植物基因文库F因子的特点又称致育因子，是一个100kb的质粒，能整合到宿主染色体中。并能高频率的转移遗传标记。F因子在大肠杆菌中的复制受到严格控制而保持低拷贝，一般为每细胞1～2个拷贝，其parB基因能够排斥细胞中的外源性F质粒，限制了细胞内质粒分子间的重排，降低了BAC中外源基因的重组和嵌合度新一代BAC载体为7.4kb的环状质粒：F因子的parA，parB，parC基因以保证低拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到子代细胞oriS基因：来源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制子BAC优点：BAC载体容载能力一般为100-350kb ,虽然容量没YAC 大，但BAC 具更多优点：1)以大肠杆菌为寄主,转化率高,构建BAC 文库比YAC 文库更容易；2)BAC 载体以环型超螺旋状态存在,从大肠杆菌中提取质粒较方便,而从酵母中分离DNA 较难；3)BAC 复制子源于F 因子,可稳定遗传,嵌合及重组现象少；4) 可通过菌落原位杂交筛选目的基因，方便快捷；5) BAC 载体在多克隆位点两侧具T7 和Sp6 聚合酶启动子，可用于转录获得RNA 探针或直接用于插入片段的末端测序 （三）人工染色体克隆载体的应用1、构建基因组文库2、基因治疗3、基因功能鉴定100-1000kb线性染色体酵母细胞YAC(YeastArtificialchromosome)PeloBAC系列≈300kb环状E.coliBAC(BacterialArtificialChromosome)EMBL系列，λgt系列9-24kb线状E.coliλ噬菌体pUC18/19,T-载体，pGEM等〈8kb环状E.coli举例插入片断结构受体细胞质粒载体的种类和特征作业：1简述质粒载体必须具备的基本条件2蓝白斑筛选重组子原理3YAC基本序列元件及其作用4BAC优点