NorthernBlot注意事项1

NorthernBlot注意事项DIG检测试剂盒疑难问题及解决 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 口一、灵敏度低或信号弱的问题及解决方案？1.探针标记效率低：膜的问题：使用阳性尼龙膜杂交：增加标记探针的浓度，或减少洗涤时的严谨性曝光时间：增加曝光时间；使用高灵敏度的专用化学发光的Lumi-Film胶片，口其他像KodakXAR也可。二、高背景解决方案?口.探针标记：纯化的DNA或RNA在标记前用乙醇沉淀；确认探针对靶序列是特口异性并跟其他载体无同源性；.膜：推荐使用罗氏或经过验证的膜(pall)、Ambion膜3.杂交：使用CDP-Star发光底物，最好将DIG探针浓度稀释到(RNA20-50ng/ml)□另外在杂交过程中不要让膜干燥.检测过程：将抗DIG-AP的酶的浓度到由原来的1:20,000减少到1:50,000，也口不会减少酶检测的灵敏度。增加洗脱和封闭的溶液的量和次数；膜上出现斑点可能是由于酶在膜上的凝集，需要将膜短暂离心后使用。5.曝光时间：缩短曝光时间，通常为15-60s。Ambion生物素化探针疑难问题解决方案口一、探针类型、设计及标记方法(一)探针类型如何选择？1.单链DNA探针：对于传统的杂交缓冲液，单链探针的效果要好于双链探针，因为双链探针可与未标记的RNA结合，降低了探针与靶RNA结合的浓度，使杂交信号减少，另外双链探针之间可以退火，降低探针的浓度。1)引物延伸法：质粒克隆或PCR产生的 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 2)非对称扩增PCR:口3)末端标记的寡核苷酸；优点:简单、经济，对于同源性较高的序列或对靶基因序列了解较少情况下适用。通常在5’末端用多聚核苷酸激酶标记，但每一个分子仅有一个可标记的基团，比内部掺入标记的探针灵敏度更低，且杂交温度需要去摸索。.双链DNA探针：有高度特异性，能用于随机引物进行标签，快速和可靠。缺点是;在杂交前需要变性。.RNA探针：质粒克隆 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达或PCR产生的DNA模板进行体外转录合成RNA探针。（二）探针设计原则;1.探针需在反义链上：才能跟mRNA互补，启动子应在3′末端编码区。双链RNA探针需含有意义链和反义链。合成单链探针时要考虑合成的是反义RNA，启动子应在3’末端。下图示意选择启动子的位置;在反义链3'端使用启动子1产生的正义RNA探针，在反义链5’端使用启动子2产生的反义链RNA探针。□.探针长度：在100-1000之间，大于1000则产生高背景,很难区分异源序列。如果用随机引物标记，探针长度为模板长度的一半。如果模板长度少于100，杂交温度和洗脱则按照寡核酸的条件进行。.探针序列：探针应含有最少的非同源序列（如载体序列、内含子等），也应含有最少的同源序列。探针尽可能含有跟模板误配的碱基。.标记：放射性或非放射性标记。.寡核苷酸探针：至少15bp,但标记效率差，灵敏度低。每一个杂交分子只有一个标签分子。（三）探针制备方法.随机引物标记法：通过切口平移或随机引物方法。质粒载体上的DNA或CDNA模板通过内切酶消化后再通过胶回收纯化。如果载体序列被标记了会产生高背景。这种方法要求模板的量不要过量，否则过量的模板会反过来与标记的模板竞争结合靶序列，减少了信号。.体外转录法：质粒上的模板应该内切酶消化后，尽量避免过多的载体序列。单链RNA探针用DNA口酶消化后去除模板DNA。□.PCR法：包括线性扩增和不对称PCR。线性扩增PCR只使用单一引物，一定要去除未结合的核苷酸。不对称PCR可使用上下游引物。但下游引物浓度更高有利于合成反义核苷酸。可使用PCR或反转录PCR为模板。□.引物延伸法：二、杂交温度的优化.RAN探针：在高温68℃,高AT含量或与靶基因出现多个误配的探针，可能杂交失败。如果在此温度信号较弱，尽量减少杂交和洗脱温度至60℃..DNA探针：如果在42度有交叉反应（非特异性带），则增加温度到45-48℃.口.寡核苷酸探针;有较低的Tm值，如果在37℃杂交信号弱或无信号，则用等量的2.5XSSC/7%SDS口稀释杂交液,再回复到37-42℃杂交和洗脱。（二）条带高背景的原因.低于最适的杂交温度：如DNA探针温度为42℃,RNA探针为65℃,如低于此温度会出现高背景或交叉反应。杂交温度需凭经验来确定.探针浓度太高:如RNA探针浓度为0.1nM,DNA化学标记法浓度为1pM,内部参入法为10pM,□放射性标记为106cpm/mL.使用更高浓度的探针，尽管克提高信号，但同时也增加了背景。3.探针含有其他的序列（三）条带及膜背景均高的原因1.预杂交时间太短：低于30min.暴露时间过长：化学显色法最佳的显色时间通常为1-30min.可以通过在不同时间、次数来得到最好的信噪比.探针中含有游离的核苷酸未能去除：未参入的游离核苷酸，可导致高背景4.杂交缓冲液没有完全溶解：应将杂交液在68℃预热15-30min,使之完全溶解。（四）跟条带不相关的高背景的原因.低质量的尼龙膜，不能使用NC膜口.膜干燥：在预杂交到暴光的总过操作过程中，膜的干燥会导致高背景。.试剂在膜上没均匀分布：不要直接将探针加到膜上或预杂交缓冲液中，先用1mL杂交液稀释探针，再加进去。确保杂交液或洗涤液等能覆盖膜并能自由移动，最好温和震荡。如果2张以上膜在同一个容器中，确保不要粘在一起，并且不要有折叠、皱褶或气泡。4.杂交缓冲液没完全溶解5.微生物污染：当抑制剂感染真菌或细菌时，易出现此现象。6.膜要保持干净：应用镊子夹在膜边沿，使用无粉的手套。7.转膜之后或交联之前膜干燥：可将膜浸在1XTBE8.其他：□洗脱或封闭试剂含有盐和变性剂在室温出现沉淀，可以在37-65℃预热溶解沉淀。2）在膜上留有凝胶或丙烯酰胺残留物，可将膜在转移缓冲液中浸泡一下，或在洗脱阶段将时间由5min延长到15min。□3）膜未能充分接触洗脱或封闭等试剂；推荐使用扁平的托盘如装Tip头的盖子，strep-AP孵育口后洗脱时间延长到15min。:4）直接将strep-AP加到膜上：可导致高浓度的酶沉积到膜上产生高背景。通过将strep-AP与口封闭剂充分混匀后再加入可避免高背景。推荐使用带刻度的离心管可上下颠倒用于稀释。5）膜上过量的CDP-Star未吸干净：将膜从托盘取出，置于滤纸上，用滤纸将膜印干去除多余的CDP-Star。□6）塑料薄膜出现折叠或凹痕:最好使用单层薄膜。7）滤纸应该充分浸泡使电流充分通过（五）信号弱或灵敏度低的原因;.杂交温度不合适:DNA探针在42℃或RNA探针在68℃杂交。如果含有更高浓度的GC或AT,探针□跟靶基因会出现误配，杂交温度则凭经验。.探针降解;特别是放射性探针易降解.探针特异性太低：对于较短寡核甘酸探针，用末端标记，可选用更长的内部标记的探针。4.探针浓度太低：放射性探针(106cpm/mL)、非放射性DNA探针(1PM),非放射性RNA探针0.1nm)5.操作问题：□1)双链探针不完全变性：2)RNA转膜效率不高3)EB染色不充分口)RNA交联时间不够或太长口5)不能使用NC膜，使用带正电荷的尼龙膜口6)探针合成效率低：标记与未标记的探针CTP比率等于2:37)探针污染严重：OD260/280应介于1.8-2.1口.暴露时间不够：低拷贝的RNA样品，等CDP-STAR2-4h达到高峰后再曝光30min-1h.样品RNA太少：一般10-20口g。可以使用mRNA(占总量的0.5-3%),还可使用更灵敏的技术如RT-PCR.□.含有太多的rRNA:靶RNA的电涌或电转可能被rRNA所抑制。□)交叉反应条带较多.探针浓度太高：非放射性标记的RNA探针0.1nM,口.杂交或洗脱条件不够严谨：DNA探针温度为42℃,RNA探针为68℃,低于此温度会导致非特异性条带。.RNA样品有多个靶序列：样品中跟探针有多个同源序列，因此重新进行探针设计时要尽量避免高同源序列区域；优化杂交温度和洗脱条件；减少探针浓度；使用双链探针能区分相似序列。4.探针含有贪多的非同源序列：探针模板不纯，引物延伸和体外转录模板应在转录起始位点的下游，PCR产生的探针应含有最少的内含子或非同源序列。□（七）最佳洗涤条件的确定第二次洗涤的严谨性可通过改变温度来实现。典型的高严谨洗涤条件是DNA探针是42℃,RNA探针为68℃，常低于Tm值10-20℃。严谨洗涤的目的是去除误配到含有相似同源序列的探针，及结合到膜上的多余探针，而留下正确配对的探针-靶序列的二聚体。当杂交温度达到Tm值，杂交信号则会大量损失。□高严谨洗涤会减少非特异性结合，Ol）RNA沉淀口1.加0.1V的乙酸铵（终浓度为0.5M）,涡旋混匀。对于低浓度的样品，可加沉淀剂糖原（10-20口g/mL）或线性的聚丙烯酰胺（10-20口g/mL）,要在乙醇添加之前加入。2.加2.5V体积的冰无水乙醇，再次混匀，-20℃放置至少30min。□3.4℃X12000rpm15min,做好标记，沉淀RNA,在背向轴中心的离心管的后侧的底部形成可见的胶样沉淀。RNA沉淀不会很紧的粘附在管底，因此要小心吸取上清液（不要倾注法）,再见在室温短暂涡旋几秒以去除残余的乙醇液体,这种方式处理不需要在空气中干燥。RNA储存：□1）长期储存：乙醇沉淀后置于-80℃2）甲酰胺保存：等体积加3）0.1mMEDTA,TE,溶液中二价阳离子能催化RNA链的裂解，EDTA,TE是螯合剂，能结合溶液中阳离子。我们发现在含0.1mMEDTA的DEPC水保存的RNA在-80℃可保存2年而完整。所用试剂：怎样才能降低背景？有以下方法：1.降低探针浓度；2.提高杂交温度；3.减少杂交时间；4.增加封闭剂浓度；5.减少抗体用量；6.降低发光底物浓度；7.缩短暴光时间8.提高洗膜的严谨度这些方法有选择性的使用,一般按我的先后顺序选择。□□□□□感谢您的阅读，祝您生活愉快。