实验三 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
一、目的
1.学习一种蛋白质染色测定的
方法
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2.掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法
二、原理
蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化,从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色,当它与蛋白质通过范德华键结合后,变为蓝色,且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律,可在595nm处比色测定。2~5分钟即呈最大光吸收,至少稳定1小时。在0.01~1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速,消耗样品量少,但不同蛋白质之间差异大,且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时,改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强,比色杯不洗干净会影响光吸收值,不可用石英怀测定。
三、器材与试剂
1.仪器
(1)分析天平;(2)具塞刻度试管10ml×8;(3)吸管 0.lml×I,lml×Z,5ml×I;(4)研钵;(5)漏斗;
(6)离心管10ml;(7)容量瓶10ml;(8)离心机;(9)721型分光光度计
2.试剂
(1)标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100ml,制成 100 pg/ml的原液。
(2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml 90%乙醇中,加入 85%(m/v)的磷酸 100ml,最后用蒸馏水定容到 1000ml。
此溶液在常温下可放置一个月。
3.材料
植物种子
四、操作步骤
1.标准曲线的制作 取6支具塞试管,编号后,按下表加入试剂。
操作项目
管 号
1 2 3 4 5 6
标准蛋白质溶液(ml)
0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0
蒸馏水(ml)
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
G-250试剂(ml)
各5
蛋白质含量(μg)
0 20 40 60 80 100
盖上塞子,摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定(比色应在 l h内完成)。以牛血清白蛋白含量(μg)为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线。
2.样品中蛋白质含量的测定
(1)准确称取约200mg绿豆芽下胚轴,放入研钵中,加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆,离心(4000r/min,10min),将上清液倒入10ml容量瓶,再向残渣中加入2ml蒸馏水,悬浮后再离心10min,合并上清液,定至刻度。
(2)另取1支具塞试管,准确加入0.l ml样品提取液,再加入0.9 ml蒸馏水,5ml考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min后,以标准曲线1号试管做参比,在595 nm波长下比色,
记录
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吸光度。
3.结果处理
根据所测样品提取液的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg),按下式计算:
样品蛋白质含量(μg/g鲜重)=(查得的蛋白质含量(μg)×提取液总体积(ml))/(样品鲜重(g)×测定时取用提取液的体积(ml))
六、注意事项
1.由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠,试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低,因而当蛋白质浓度较大时,标准曲线稍有弯曲,但直线弯曲程度很轻,不致影响测定
2.测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始,力争1hr内完成,否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。
3.样品中的Tris、乙酸、2-巯基乙醇、EDTA等物质对实验结果有少量颜色干扰,可以在做标准曲线时可以用缓冲液代替蒸馏水,就可以将干扰扣除,
七、思考
题
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1.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么?还有哪些蛋白质定量法?
2.如何正确使用分光光度计?
八、参考文献
鲁子贤.蛋白质化学.北京:科学出版社,1981
文树基.基础生物化学实验指导.西安:陕西科学技术出版社,1994
张龙翔.生物化学实验技术.北京:人民教育出版社,1981