茚三酮比色测定氨基酸含量
一、实验原理
氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。
二、实验试剂
（1）1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2? H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。
（2）pH 8.04磷酸缓冲液：
Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。
Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。
（3）氨基酸
标准
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溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL氨基酸标准溶液。
三、实验方法及步骤
（1）标准曲线绘制
准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于90℃水浴上加热至显色恒定为止（该加热过程至少需要25分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A；若生成的化合物呈黄色，则在350nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
图1 350nm波长下氨基酸与吸光度线性关系图（雷恩，2016）
（2）提取样品
称取1.0-2.0g植物样品（新鲜样或干样），加5mL 10%醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入100mL容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。该样品提取液可继续用来测定可溶性蛋白质含量（考马斯亮蓝G-250法）
（3）样品测定
吸取澄清的样品溶液4mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，测得的A值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。
（4）结果计算
氨基酸含量（μg /100g）=
式中：
c—从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，μg；
m—测定的样品溶液相当于样品的质量，g。
四、说明及
注意事项
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（1）茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化，方法如下：取10g茚三酮溶于40mL热水中，加入1g活性炭，摇动1分钟，静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，装瓶备用。
（2）应控制反应溶液的pH才能得到重现性好的结果，反应液pH在6.2 - 6.4之间为宜，所加试液和缓冲液的量的比例可为2:1或1:1。
（3）要控制加热温度和时间，温度过高容易褪色，温度低发色不全。沸水浴中加热发色快，但可能受热不均匀及容易褪色，可以降低温度（80℃），延长加热时间，使发色均匀。也可以在烘箱中加热，105℃烘10分钟。
（4）茚三酮与氨基酸反应生成的颜色在1小时内稳定，浓度高时褪色较快，应在发色稳定、加水定容后，在半小时内比色。
（5）明显带色的试样，可以用活性炭脱色，但某些氨基酸（酪氨酸等）也被活性炭吸附，会使结果降低。
（6）茚三酮与氨、胺类、氨基糖类、尿素、蛋白质等也发生反应，这些物质会干扰测定。
（7）植物样品处理方法不同，游离氨基酸组成会有变化，应用分析结果时应说明样品处理
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