BD SMART RACE cDNA Amplification Kit User Manual(Chinese)

BD SMART? RACE cDNA Amplification Kit User Manual Table of Contents 内容 页码 I. 概要简介   II. 成分   III. 另备物品   IV. BD SMART RACE Amplification 基本原理   V. 引物设计   VI. Poly A+ RNA 和总RNA 的制备   VII. cDNA 的第一链的合成   VIII. PCR 阳性对照   IX. cDNA末端的快速扩增(RACE)1   X. RACE 产物鉴定   XI. 疑难解答   XII. 参考文献   XIII. 相关产品   附录A: 5'-RACE 流程图示   附录B: 3'-RACE 流程图示   附录C: Suppression PCR and Step-Out PCR 39       I. 简要概述 II. 成分列 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf Control Human PlacentalTotal RNA 和 BD SMART II A Oligonucleotide在–70°C下保存。 NucleoTrap Gel Extraction Kit 室温下保存。 其余试剂–20°C下保存。 随BD SMART RACE cDNA Amplification Kit 同时免费提供BD PowerScript Reverse Transcriptase和BD Advantage 2 PCR Kit。所有试剂可以满足7 次cDNA 合成反应和30次PCR反应。 First-strand cDNA 合成 ?7μl  BD SMART II? A Oligonucleotide (12 μM) 5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3' ? 7μl  3'-RACE CDS Primer A (3'-CDS; 12 μM) 5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N–3' (N = A, C, G, or T; V = A, G, or C) ? 7μl  5'-RACE CDS Primer (5'-CDS; 12 μM) 5'–(T)25V N–3' (N = A, C, G, or T; V = A, G, or C) ? 7μl    BD PowerScript? Reverse Transcriptase ? 200 μl   5X First-Strand Buffer 250 mM Tris-HCl (pH 8.3) 375 mM KCl 30 mM MgCl2 ? 200 μl  Dithiothreitol (DTT; 20 mM) ? 1ml    Deionized H2O 5'- & 3'-RACE PCR ? 400 μl    10X Universal Primer A Mix (UPM) Long (0.4 μM): 5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3' Short (2 μM): 5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3' ? 50 μl    Nested Universal Primer A (NUP; 10 μM) 5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3' Control Reagents ? 5μl    Control Human Placental Total RNA (1 μg/μl) ? 25 μl  Control 5'-RACE TFR Primer (10 μM) ? 25 μl  Control 3'-RACE TFR Primer (10 μM) General Reagents ? 70 μl      dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM) ? 2 X 1 ml  Tricine-EDTA Buffer 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5) 1.0 mM EDTA NucleoTrap? Gel Extraction Kit (Cat. No. 636053 or K3070-y) ? 100 μl      NucleoTrap Suspension ? 3 ml        NT1 Buffer ? 10 ml      NT2 Buffer ? 2ml        NT3 Buffer ?      User Manual (PT3169-1) Free trial-size BD Advantage? 2 PCR Kit (Cat. No. 639207 or K1910-y) The BD Advantage 2 kit provides sufficient reagents for 30 PCR reactions. The following components are included: ? 30 μl          50X BD Advantage 2 Polymerase Mix ? 200 μl        10X BD Advantage 2 PCR Buffer ? 50 μl          50X dNTP Mix (10 mM each) ? 30 μl          Control DNA Template (100 ng/μl) ? 30 μl          Control Primer Mix (10 μM each) ? 1 ml          PCR-Grade Water ?            User Manual (PT3281-1) III. 另备物品 下列试剂需另外准备： ? 0.5-ml PCR 反应管，推荐使用 PerkinElmer GeneAmp 0.5-ml reaction tubes (Cat. No. N801-0737 or N801-0180). ? Mineral oil (e.g., Sigma Cat. No. M-3516) IV. BD SMART RACE的要点 使用前请全面阅读 ?所有参数均经过优化，但可能因所使用的酶、模版、引物和热循环仪而不同。因此应使用Control Human Placental Total RNA和Control 5'- and 3'- RACE TFR Primers进行预实验。 ?RACE PCR的效率取决于试验样品RNA中mRNA的丰度。另外退火温度和延伸温度也依引物不同而变化。请参照第X节的建议优化PCR的条件。 ?在进行5'-RACE and 3'-RACE PCR时必须使用热启动。本手册已经过优化，所使用的BD Advantage 2 Polymerase Mix中包含BD TaqStart 抗体用于自动进行PCR的热启动 (Kellogg et al., 1994)。也可以手动(D’Aquila et al., 1991).或使用蜡珠(Chou et al., 1992)来进行热启动。 ?推荐使用试剂盒中提供的Tricine-EDTA缓冲液稀释和重悬DNA样品。Tricine缓冲液在高温下较Tris-based缓冲液有更好的缓冲能力。Trisbased 缓冲液会导致pH降低，引起DNA的降解。 ?整个过程要戴手套以防核酸酶污染。 ? 重悬过程（包括吸入和吹出溶液）要轻缓，短暂离心使所有成分聚集管底。 ? 无特别标示，所有操作均应在冰上进行。 ? 聚合酶在最后加入。 ? 使用推荐的酶加入量，该量已经过特别的优化。 ? EB是致癌物质，小心处理和使用。 V. 引物设计 A. 引物序列 特异引物(GSPs) 应当： ? 23–28 个核苷酸 ? GC含量为 50–70% ? Tm 大于或等于65°C，如果Tm >70°C可获得最好的结果 (可使用降落PCR)。 模版、引物及RACE产物如图3所示。至少需要两个特异引物才能进行完整的BD SMART RACE：即用于5'-RACE PCR的反义引物和用于3'-RACE PCR的正义引物。如果只进行5'- 或3'-RACE则只需一个特异引物。引物长度在23–28个核苷酸，长于30个核苷酸没有优势。 如图3所示，两种引物的5'- and 3'-RACE扩增产物存在部分重叠，如果在重叠区有一个合适的限制性酶切位点，可以通过酶切和连接反应可以得到cDNA的全长。将两个引物设计成其RACE产物有100–200-bp的重叠的形式，就能够配合使用作为PCR反应的阳性对照。引物并非一定要设计成获得重叠片断的形式。对于大或稀有cDNAs，引物最好要设计的尽量靠近cDNA的末端，不产生重叠。此外，引物自身可以重叠（如互补）。 特异引物GC含量为50–70% ，其至少 65°C。使用nearest neighbor 分析 (Freier et al., 1986; 我们使用Primer Premier软件来计算Tm’s) Tm.应尽可能大于70°C。根据我们的经验，长引物的退火温度高于70°C特别从困难的样品中可以得到强的RACE扩增。 Tm’s 超过70°C 可以使用降落PCR。此外GSP1和GSP2设计成具有相似的Tm’将更有利于使用。通过计算或试验能够得到GSP1和GSP2的Tm’s。要避免使用内部互补的引物或引物之间互补的引物，尤其在引物的3'末端互补。 注意：不要将酶切位点都合并到5'和3'特异引物的5'末端，根据我们的经验，这些额外的序列将会增加反应的背景。 Figure 3. The relationship of gene-specific primers to the cDNA template. B. 引物在基因上的位置 尽管我们使用BD SMART RACE Kit成功地得到了大于6.5 kb扩增产物，但为了使你的5'-和3'-RACE 产物达到2 kb，建议对引物加以筛选。 C. 降落PCR 我们发现降落PCR (Don et al., 1991; Roux, 1995)明显增加BD SMART RACE扩增的特异性。降落PCR的退火温度符合首次PCR循环的Tm 高于通用引物的Tm 。如果你的特异引物Tm，在这些循环中将只有与基因特异性结合的引物发生聚合，从而积累一定量的特定产物。退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度，引起特异性基因模版的指数和高效率的扩增。