高级食品生化专题二-第1章

生物大分子的分离提取与纯化专题二一、物质的性质与提取物质的性质与提取方法的选择要取得好的提取效果，最重要的是要针对生物材料和目的物的性质，选择合适的溶剂系统与提取条件。生物材料及目的物与有关的一些性状，包括溶解性质、相对分子质量、等电点、存在方式、稳定性、比重、粒度、粘度、目的物含量、主要杂质种类及溶解性质、有关酶类的特征等。其中最重要的是目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性。第一章在提取过程中尽量增加目的物的溶解度，尽可能降低杂质的溶解度，同时充分重视生物材料及目的物再提取过程中的活性变化。对酶类的提取要防止辅酶的丢失和其他失活因素的干扰。对蛋白质类要防止其高级结构的破坏，即变性作用，应避免高热，强烈搅拌，产生大量泡沫，强酸、强碱及重金属离子的作用。多肽类及核酸类需注意避免酶的降解作用。提取过程中，应在低温下进行，并添加某些酶抑制剂。对脂类生化制品应特别注意防止氧化作用，减少与空气的接触，如添加抗氧化剂、通氮气及避光等。二、生物大分子活性物质的存在方式1、生物大分子活性物质的存在方式生物活性物质分为胞内和胞外两种存在部位胞外:消化酶淀粉酶、蛋白质水解酶、糖化酶难于从消化道收集，只能由相应的腺体提取分离。胞内:细胞质RNA细胞核真核生物DNA线粒体电子传递系统物质、糖类、脂肪酸氧化分解的酶类对于胞内物质的提取要先破碎细胞，对于膜上物质则要选择适当的溶剂使其从膜上溶解下来。2、生物大分子间的作用力作为生物大分子，其基本骨架中各原子与基团间都是共价结合，整个分子的一级结构比较稳定，但分子间的连接主要是通过一些非共价键如氢键、盐键、范德华力、碱基堆积力所维系，其键能较弱，它们与生物分子的生物功能关系十分密切，因此要采取不同方法使之解离，而不损伤其分子基本结构，同时确保空间结构不受破坏。故常常在十分温和的条件下操作，以避免因强烈外界因素的作用而丧失其生物活性。三、生物大分子活性物质的存在特点1、生物材料组成的复杂性生物材料中的化学组成十分复杂，不同生物含有不同种类的活性物质。同种生物在细胞与细胞之间、组织与组织之间，由于细胞类型、年龄、分化程度不同都会改变活性物质的组成。植物：叶绿素、胡萝卜素、花色素类动物：细胞色素、原卟啉、藻类：藻胆色素2、生物大分子存在的特点A、生物活性物质在生物材料中含量较低，杂质含量较高，而且生理活性愈高的成分，含量往往愈低。如胰岛素在胰脏中的含量约为万分之二，脱氧核糖核酸酶含量为十万分之四，胆汁中的胆红素含量为万分之五。B、生物材料中的生化组成数量大、种类多目的物与杂质的理化性质如溶解度、相对分子量、等电点都十分接近。在纯化过程中生物材料中有效成分的生理活性处于不断变化中，它们可能被材料中自身的代谢酶所破坏，或为微生物活动所分解，还可能在制备过程中受到酸碱、盐、重金属离子、机械搅拌、温度的作用改变其生理活性。四、生物大分子常规的提取方法选择性提取包含着分离纯化；沉淀分离包含着浓缩；从发酵液中分离胞外酶，则不用破碎细胞离心去菌体后，就可直接进行分离纯化。选择性溶解和沉淀经常交替使用，各种柱层析常放在纯化的后阶段结晶五、原料的选择（1）生物的生长期：如凝乳酶只能以哺乳期小牛、仔羊的第四胃为材料，成年牛、羊胃不适用。提取胸腺素应选用幼年动物胸腺为原料。（2）合适的组织器官：如提取DNA，从含量上看，细胞核中最多，线粒体次之，但由于在从动物脏器提取细胞核过程中，常会受到酶水解和机械损伤等作用，致使得到的细胞核DNA相对分子量（2×108～5×108）仅为其完整DNA的1%，而线粒体DNA，由于相对分子质量较小（127），提取步骤也较少，所以提取DNA时选用线粒体作材料。（3）杂质情况难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响回收率、质量和经济效益。选材时，应避免与目的物相似的杂质对纯化过程的干扰。如胰脏含磷酸单酯酶和磷酸二酯酶，两者难于分开，故不选用胰脏为原料制备磷酸单酯酶，而改用前列腺为原料。（4）来源应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好一物多用。如用胰脏可同时制备弹性蛋白酶、激肽释放酶、胰岛素和胰酶。总之，提取是分离纯化的前提，将经过预处理或破碎的细胞或组织置于一定条件下或溶剂中，使被提取的生物大分子以溶解状态充分的释放出来，并尽可能保持原来的天然状态，不丢失生物活性的过程。用冷溶剂从固体物质提取的过程可称为浸渍。用热溶剂则可称为浸提，也称浸煮。提取通常贯穿再分离纯化过程中，包括生化物质与细胞固体或其他相结合物质由固相转移到液相中，或从细胞内的生理状态转入外界特定的溶液中。提取可分为两类：一类是对固体的提取，也称液－固提取，被处理的原料为固体；另一类是对液体的提取，也称液－液提取（习惯上多称为萃取），被处理的原料为液体。六、生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化技术包括：生物大分子的分离分析和生物大分子的制备。前者主要对生物体内各组分加以分离后进行定性、定量鉴定，它不一定要把某组分从混合物中分离提取出来。而后者则主要是为了获得生物体内某一单纯组分。为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物产品制备中的分离方法多采用温和的“多阶式”方法进行，即常说的“逐级分离”方法。为了纯化一种生化物质常常要联合几个、甚至十几个步骤，并不断变换各种不同类型的分离方法，才能达到目的。（一）分离纯化原理生物大分子的分离制备技术大都根据混合物中的不同组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中（如有机溶剂抽提、盐析、结晶等）。或者将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，外加一定作用力，使多组分分配于不同区域，从而达到分离目的（如电泳、超离心、超滤等）。除了一些小分子如氨基酸、脂肪酸，某些维生素及固醇类外，几乎所有生物大分子都不能融化，也不能蒸发，只限于分配在固相或液相中，并在两相中相互交替进行分离纯化。在实际操作中，我们往往根据一些原理对生物大分子进行分离纯化。根据分子形状和大小不同进行分离，如差速离心与超离心、膜分离（透析、电渗析）与超滤法、凝胶过滤法。根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离，如离子交换法、电泳法、等电聚焦法。根据分子极性大小及溶解度不同进行分离，如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法及以及溶剂分级沉淀法。根据物质吸附性质的不同进行分离，如选择性吸附与吸附层析法。根据配体特异性进行分离，如亲和层析法。精制一个具体生物产品，常常需要根据它的各种理化性质和生物学活性，采用以上各种分离方法进行有机组合，才能达到预期目的。（二）分离纯化初期使用方法的选择与使用程序分离纯化初期使用方法的选择与使用的程序：1．分离纯化初期使用方法的选择2．各种分离纯化方法的使用程序3．分离后期的保护性措施七、生物大分子活性物质的浓缩浓缩使从低浓度的溶液除去水或溶剂变为高浓度的溶液。生化产品制备工艺中往往在提取后和结晶前进行浓缩。加热和减压蒸发使最常用的方法，一些分离提纯方法也能起浓缩作用。例如，离子交换法与吸附法使稀溶液通过离子交换柱或吸附柱，溶质被吸附以后，再用少量洗脱液洗脱、分部收集，能够使所需物质的浓度提高几倍以至几十倍。超滤法利用半透膜钠光载留大分子的性质，很适于浓缩生物大分子。此外，加沉淀剂、溶剂萃取、亲和层析等方法等也能达到浓缩目的。下面重点介绍几种浓缩方法：（一）盐析法用添加中性盐的方法来使某些蛋白质（或酶）从稀溶液中沉淀出来，从而达到样品浓缩的目的。最常用的中性盐是硫酸铵，其次是硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸钾等。（二）常压蒸发法蒸发是溶液 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面的水或溶剂分子获得的动能超过溶液内分子间的吸引力以后，脱离液面进入空间的过程。可以借助蒸发从溶液中除去水或溶剂使溶液浓缩。在常压下加热使溶剂蒸发，最后溶液被浓缩称为常压蒸发。该方法操作简单，但仅适用于浓缩耐热物质及回收溶剂。装液容器于接收器之间要安装冷凝管使溶剂的蒸汽冷凝。装液要求需用圆底蒸馏瓶，装液量不宜超过蒸馏瓶的1/2容积，以免沸腾时溶液雾滴被蒸气带走或溶液冲出蒸馏瓶。加热前需加少量玻璃珠或碎瓷片，使溶液不致过热暴沸。暴沸易使液体冲出，或使蒸馏瓶压力陡增二致破裂。操作时，先接通冷却水，避免直接加热，要选用适当的热浴。热浴温度较溶剂沸点高20～30℃，温度过高使蒸发速度太快，蒸馏瓶内的蒸气压超过大气压以后易将瓶塞冲开，逸出大量蒸气，甚至使蒸馏瓶炸裂。普通减压的加温蒸发器常用圆底烧瓶，先将液体加入容器，接通冷却水，再打开真空泵。开始时减压要缓慢，加热致一定温度后，溶剂即大量蒸发。如气泡过多，应立即打开阀门，降低真空度。真空减压浓缩在生物产品生产中使用较为普通，具有生产规模较大、蒸发温度较低、蒸发速率较快等优点。此法适于浓缩遇热易变性的物质，特别是蛋白质、酶、核酸等生物大分子。当盛液的容器与真空泵相连二减压时，溶液表面的蒸发速率将随真空度的增高而增大，从而达到加速液体蒸发浓缩的目的。近年来，从蒸发速度方面改善蒸发器的发展较快，如薄膜蒸发器便是其中一例。薄膜浓缩法的加速蒸发原理是增加汽化表面积，使液体形成薄膜而蒸发，成膜的液体具有极大的表面积。热的传导快而均匀，没有液体静压的影响，能较好地防止样品的过热现象，样品总的受热时间也有所压缩，而且能连续进行操作。（三）真空减压浓缩与薄膜浓缩法八、生物大分子的结晶结晶是使溶质呈晶态从溶液中析出的过程。由于初析出的结晶多少会带有一些杂质，因此需要反复结晶才能得到较纯的产品。从比较不纯的结晶再通过结晶作用精制得到较纯的结晶，这一过程叫做重结晶（或称再结晶、复结晶）。结晶是分离纯化蛋白质、酶等生化产品的一种有效手段。变性蛋白质不能结晶，所以凡结晶状态的蛋白质都能保持天然状态。晶体内部有规律的结构，决定了晶体的形成必是相同的离子或分子，才可能按一定距离周期性地定向排列而成，所以能形成晶体的物质是比较纯的。在生化制备中，许多小分子物质如各种有机酸、单糖、核苷酸、维生素、辅酶等，由于其结构比较简单，分离至一定纯度后，绝大部分都可以定向聚合形成分子型或离子型的晶体。但有的生化产品，如核酸，由于分子高度不对称，呈麻花形螺旋结构，虽已达到很高的纯度，也只能得到絮状或雪花装的固体。常用的干燥方法的选择1.常压真空干燥常压干燥是在密闭空间内用干燥剂吸水或溶剂。此法的关键是选用合适的干燥剂。按照脱水方式，干燥剂分为三种：（1）能与水可逆地结合的水合物，例如无水氯化钙、无水硫酸钠、无水硫酸钙、固体氢氧化钾（或钠）等。（2）能与水作用生成新的化合物，例如五氧化二磷、氧化钙等。（3）能吸收微量的水和溶剂，例如分子筛，常用的是沸石分子筛。如果样品水分过多，应先用其他干燥剂吸水，再用分子筛进行干燥。2．减压真空干燥3．喷雾干燥4．冷冻干燥影响干燥的因素：1、蒸发面积蒸发面积大，有利于干燥，干燥效率与蒸发面积呈正比。如果物料厚度增加，蒸发面积减小，难于干燥，由此会引起温度升高使部分物料结快、发霉变质。2、干燥速度干燥速度应适当控制。干燥时，首先时表面蒸发，然后内部的水分子扩散至表面，继续蒸发。如果干燥速率过快，表面水分很快蒸发，就使得表面形成得固体微粒互相紧密粘结，甚至成壳，妨碍内部水分扩散至表面。3、温度升温能使蒸发速率加快，蒸发量加大，有利于干燥。对不耐热得生化物质，干燥温度不宜过高，冷冻干燥最适宜。4、湿度物料所处空间得相对湿度越低，越有利于干燥。相对湿度过高达到饱和，则蒸发停止，无法进行干燥。5、压力蒸发速率与压力成反比，减压能有效地加快蒸发速率。减压法是生化制品干燥最好方法之一。