细菌和噬菌体的重组和连锁

第一节细菌和病毒在遗传学研究中的地位第二节细菌的遗传分析第三节噬菌体的遗传分析本章要点第五章细菌和噬菌体的重组和连锁第一节细菌和病毒在遗传学研究中的地位细菌和病毒在遗传学研究中的优越性:①繁殖速度快、世代所需时间短，缩短了实验周期；③便于研究基因的突变：细菌和病毒均属于单倍体，所有突变都能立即 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现出来，不存在显性掩盖隐性的问题；④便于研究基因的作用：通过基本培养基和选择培养基的影印培养，很容易筛选出营养缺陷型，利于生化研究。⑤易于管理和进行化学分析：个体小，繁殖方便，可以大量节省人力、物力和财力；且代谢旺盛，繁殖又快，累积大量的代谢产物。⑥遗传物质较简单，便于用作研究基因结构、功能及调控机制的材料。⑦可作为研究高等生物的简单模型；第二节、细菌的遗传分析一、细菌概述①无真正的细胞核，只有染色体区，称拟核区。不进行减数分裂和有丝分裂。而是简单地复制和一分为二。②缺乏线粒体、叶绿体等细胞器。③单细胞生物，其染色体为环形、裸露双链DNA分子，较易插入DNA片断。细胞壁(cellwall)细胞膜(plasmamembrane)拟核(Nucleoid)性纤毛(pili)核糖体(Ribosome)(Flagella)（一）细菌的突变型1.合成代谢功能突变型:营养缺陷型（auxotroph)野生型（wildtype)缺陷型（deficient)原养型（prototroph)Met-甲硫氨基酸缺陷型Met+Thi-硫胺缺陷型Thi+Pur-嘌呤缺陷型Pur+2.分解代谢功能突变型：lac-乳糖突变型，野生型为lac+3.抗性突变型：抗药性或抗感染性Strr,Strs分别表示对链霉素有抗性和敏感T1r,T1s分别表示对T1噬菌体有抗性和敏感二、细菌的突变型和筛选（二）突变型的筛选1.根据菌落特点筛选——选择培养基：如Lac-突变菌株在伊红-美蓝培养基（EMB）上形成白色或粉红色菌落，而lac+菌落为有金属光泽的紫色菌落。2.抗性突变型的筛选：将细菌涂布在含有某种抗生素或噬菌体的培养基上，能形成菌落的就是抗性突变菌株。3.营养缺陷型的筛选：用印迹法把在完全培养基上生长的菌落影印到基本培养基上，鉴别出不能生长的克隆。再把它们转移到含有单一营养物质的培养基上，判定该突变型需要哪一种营养物质。三细菌的杂交和性别细菌之间遗传物质的转移主要有四种方式：转化:指某些细菌(或其它生物)能通过其细胞膜摄取周围介质中的DNA片段，并将此外源DNA片段整合到自己染色体组中的过程。转化的过程非感受态细胞外源DNA被洗掉了转化因子感受态细胞外源DNA仍与细胞结合整合吸收洗涤吸附接合：由供体菌和受体菌之间的直接接触而导致的遗传物质的单向转移。接合管的形成：菌株靠近→细胞膜融合→两细胞间形成接合管性导：是接合的一种，F΄因子所携带的细菌基因通过接合而导入受体细菌。转导：由噬菌体所介导的DNA从供体菌到受体菌的转移。(一)细菌的杂交1、大肠杆菌杂交试验菌株A:met-bio-thr+leu+thi+（需甲硫氨酸和生物素）菌株B:met+bio+thr-leu-thi-（需苏氨酸，亮氨酸和硫胺）AB完全液体培养基基本固体培养基出现若干原养型菌落，频率为10-7，。说明菌株A和B可以杂交，交换遗传物质，出现基因重组不是基因突变2、U实验1950年Davis（戴维斯），做了U实验，在U底部中间用滤片隔开，交替吸压原养型（基因重组）产生的必要条件：A、B两菌株直接接触(二)细菌的性别？AB两细胞遗传物质是混合，还是单向转移1953年Hayes(海斯)在验证杂交时偶尔发现杂交中AB细菌作用不同，遗传物质是单向转移，A→B，不能B→A。实验：菌株A:met-thr+leu+thi+（需甲硫氨酸）菌株B:met+thr-leu-thi-（需苏氨酸，亮氨酸和硫胺）结果不同，表明A、B有性杂交作用不同，提出遗传物质单向转移。供体：提供遗传物质的细菌雄性A受体：接受遗传物质的细菌雌性B所以A→B不久发现导致单向转移的是细胞质中一个微小可转移因子——F因子四、大肠杆菌F-F+HfrF΄菌株（一）F-F+菌株1、F因子结构:细胞质中环状DNA原点：转录起点形成性伞毛的基因群：通过性伞毛与F-细菌接合。DNA复制酶基因：与F因子本身的复制有关；插入序列：与其插入细菌染色体的过程有关。2、F因子存在方式游离状态：在细胞质中，能自我复制独立遗传整合状态：整合到细菌环状染色体上，与细菌染色体一起遗传。3、F因子的特性（1）决定大肠杆菌育性：F+菌株，含游离F因子供体雄性F－菌株，无游离F因子受体雌性（2）F因子高频率转移当F+×F－,F+的F因子复制为二,通过接合管将F因子传递给F－菌株,使F－转变为F+,频率高达95%,即高频率的转移F因子.F因子转移：F因子从原点断裂，以原点为先导，边复制边转移（因此叫滚环复制），复制后的F因子转移到另一个细胞中。细胞分开，使F-变成F+。(3)基因重组的频率低当F+×F－,F+菌株环状DNA复制通过接合管进入F-细菌细胞，与F-细菌的基因交换，使基因重组，但频率很低，不到百万分之一。(4)F因子可以自发丧失（二）高频重组菌株（Hfr菌株）1951年，卡瓦里（Cavalli）等人，1954年海斯（Hayes）先后在A菌株中分离出新的菌株。1、Hfr形成F因子整合到细菌环状DNA上，这种整合状态F＋菌株叫Hfr（高频重组）。2、特点(1)可以作为供体，与B杂交，重组频率比A×B高1000倍，称高频重组菌株。(2)转移F因子频率低3、Hfr×F-杂交过程也是先形成接合管，然后Hfr边复制边转移。整合到细菌环状染色体上的F因子容易在原点处断开，将细菌环状染色体上基因带入受体细胞中，基因重组频率高。但在转移过程中，结合管很易断开，这样转移到受体的部分只是靠近原点的一部分（全部转移需温和条件120分钟），形成部分二倍体。致育基因位于最后，而接合管随时可能断开，转移F因子频率低。(三)接合生殖和交换特点1、接合生殖供体细菌的DNA通过接合管进入受体细菌，实现基因重组的方式。2、基因重组（1）形成部分二倍体：一个完整的基因组和一个不完整的基因组所构成的二倍体。其中受体的基因组叫内基因子，供体的基因组叫外基因子。外基因子转移到受体以后：a)以游离状态存在，随着细胞分裂代数的增加被稀释，消失；b）与内基因子发生交换、重组。(2)基因交换过程：（3）交换特点①交换发生在完整的F－环状染色体和供体线性染色体片段之间即部分二倍体②只有偶数交换才能产生平衡的重组子。③只出现一种重组子（杂交后代），无对应重组体，真核生物出现四种杂交后代。(五)F-,F+,Hfr,F΄细菌的相互转化F+F-HfrF+F-F+F-接合吖黄素高频重组低频重组整合F΄F΄重组频率较低(四)F΄菌株F因子可从Hfr脱离成为F+，通常准确脱离，偶尔不准，使F因子带有细菌的个别基因。这种带有细菌个别基因的F因子，称F΄菌株。五、细菌的遗传作图（一）利用中断杂交试验作图叠氮化钠噬菌体乳糖半乳糖链霉素Hfrazirtonrlac+gal+strsF-：azistonslac-gal-strr将Hfr与F-同时加入装有完全培养基的大试管中，一定时间取样振荡，稀释接种至添加str的基本培养基（葡萄糖和无机盐）上，生长形成的菌落基因型为F-或具Hfr部分基因的F-，再把菌落分别转移到只添加azi、ton、以lac或gal为炭源的选择性培养基上。时间进入F-的Hfr基因＜9不生长有噬菌斑不生长不生长无9/生长有噬菌斑不生长不生长azir11/生长无噬菌斑不生长不生长azirtonr18/生长无噬菌斑生长不生长azirtonrlac+24/生长无噬菌斑生长生长azirtonrlac+gal+F因子约在120分钟后进入。（1）Hfr的基因按一定顺序和时间间隔进入F-（2）每个基因进入F-有一定频率，且在短时间内达到最高（3）进入F-越早，频率越高（4）F因子进入迟，频率低3、Hfr染色体上基因排列顺序4、细菌染色体为环状用不同Hfr菌株进行中断杂交试验，基因转移的顺序，转移起点和转移方向很不相同。abcdefgh(二）重组作图当两个基因间的转移时间小于两分钟时，则用中断杂交作图就不可靠，而必须用传统的重组作图(recombinationmapping)与中断杂交技术相互对照和补充，提高作图精度。如根据中断杂交，知道lac与ade紧密连锁且ade+是在lac+后进入，距离约为1分钟，进行以下杂交：紫红色菌落：lac+ade+780（亲本型）白色或粉红色菌落：lac-ade+220（重组型）Hfr:lac+ade+strsXF-:lac-ade-strr混合作用60min，在含链霉素、不加腺嘌呤的完全培养基上涂板，只有重组子能够存活：F-:ade+strr1000影印到EMB培养基上(1)重组子的产生Lac-ade+strrLac+ade+strrLac+ade+strsLac-ade-strrLac-ade-strsLac+ade+strsLac-ade-strrLac+ade-strs两基因间未发生交换两基因间发生交换(2)重组频率的计算RFlac-ade=*100%lac-ade+lac+ade++lac-ade+用重组频率（RF）所测得的基因距离与用中断杂交技术以时间为单位的基因距离基本上是成正比的，大致是1分钟相当于20%重组值，即：1min=20cM=*100%=22%2201000一病毒概述病毒是比细菌更为简单的生物，它们也只有一条染色体，即单倍体。有些病毒的染色体是DNA，还有一些病毒是RNA。病毒主要是由蛋白质外壳及其包被的核酸所组成的颗粒。病毒可根据宿主(动物、植物、细菌)或遗传物质(DNA或RNA)来分类。第三节噬菌体的遗传分析T噬菌体的结构蛋白质外壳核酸二噬菌体的繁殖和感染周期（一）烈性噬菌体:是使宿主菌发生裂解的噬菌体，如T噬菌体。吸附细菌裂解,释放出子代噬菌体颗粒细菌染色体降解噬菌体DNA和蛋白质外壳包装成子代噬菌体颗粒(二)温和噬菌体温和噬菌体侵入细菌后，不立即导致溶菌，这种现象称为溶源性。整合的噬菌体称为原噬菌体。吸附溶菌周期-uv诱导细菌裂解溶源周期如噬菌体:原噬菌体三噬菌体的突变型（一）宿主范围突变型E.coliBE.coliB/2E.coliB+E.coliB/2h++-半透明噬菌斑h++透明噬菌斑（二）噬菌斑形态突变型1.r+小噬菌斑,边缘模糊:2个以上噬菌体同时侵袭时,出现溶菌阻碍现象(lysisinhibition).2.r大噬菌斑,边缘清晰:快速溶菌(rapidlysis),无溶菌阻碍现象(lysisinhibition)四噬菌体的基因重组用T2噬菌体hr+和h+r混合感染E.coliB,再用释放出来的子代噬菌体感染E.coliB+E.coliB/2,出现四种噬菌斑:透明小噬菌斑(hr+)半透明大噬菌斑(h+r)透明大噬菌斑(hr)半透明小噬菌斑(h+r+)重组率=重组噬菌斑数总噬菌斑数h+r++hr总噬菌斑数=连锁图T2快速溶菌突变型有多种，如ra、rb、rc都形成大噬菌斑，用不同类型快速溶菌突变型与宿主范围突变型杂交（rxh×rh+)，结果如下：杂交组合h+rhr+h+r+hr重组值h-r图距h+ra×hr+34.0%42%12%12%24%24h+rb×hr+32.0%56%5.9%6.4%12.3%12.3h+rc×hr+39.0%59%0.7%0.9%1.6%1.6按图距h、ra、rb、rc有4种排列如（1）（2）rb、rc同侧，则drb-rc＜drb-h如（3）（4）rb、rc两侧，则drb-rc＞drb-h求drb-rcB型快速溶菌rbrc+×C型快速溶菌rb+rc,混合感染大肠杆菌B子代噬菌体rbrc+rb+rcrb+rc+rbrc噬菌斑大大小大交换值＝(rb+rc+＋rbrc)/总×100%＝2×小噬菌斑/总×100%求出drb-rc＜drb-h，rb、rc在同侧实验表明（1）（2）都成立，提出连锁图为环状五转导与作图转导(transduction):以噬菌体为媒介,将细菌的染色体片段或基因从一个细菌转移到另一个细菌.供体A受体B（一）普遍性转导（二）局限性转导（三）转导的特点（1）转导是以噬菌体为介导的；（2）重组发生在部分二倍体中；（3）只出现一种重组子，不出现相反的重组子（如gal-消失，只剩下gal+）。噬菌体(一)普遍性转导普遍性转导(generalizedtransduction):噬菌体携带供体染色体片段是完全随机的,供体染色体中所有基因具有同等机会被转导入受体,而且各个标记基因被转移的频率大致相等.这是因为噬菌体将供体染色体降解，在合成自身DNA和包装时，偶尔会将细菌染色体片段包装进入子代噬菌体颗粒，并带入受体菌。普遍性转导的频率较低,约为10-5,两个基因同时转导的频率则更低,仅有10-510-5=10-10.如果两个基因同时转导的频率则较高,则说明它们相互连锁,成为共转导(cotransduction).共转导的频率越高,则基因连锁越紧密.反之则基因距离越远.据此可用于细菌染色体的基因作图.(二)局限性转导(restrictedtransduction)又叫特异性转导(specializedtransduction),这类噬菌体只能转移细菌染色体的特定部分和基因.如噬菌体是一种附加体(episome),即可作为一个复制因子独立存在，又可以整合到细菌染色体上的特定位点——attB位点,而形成原噬菌体。attB位点一边是gal基因，另一边是bio。在紫外线诱导下，原噬菌体从细菌染色体上离开时，偶尔带有宿主细菌基因，包装形成局限性转导的噬菌体颗粒，可将供体基因转移至受体细菌，但仅限于靠近attB位点附近的基因，如噬菌体专门转导gal和bio基因。局限性转导的特点1.受包装容量限制，局限性转导形成的噬菌体颗粒往往是缺失体(defective)，用dgal或dbio表示。由于缺失一段自身DNA，不能产生成熟的颗粒，因此局限性转导的频率很低，只有10-6，所以又称为低频转导（lowfrequencytransduction，LFT）。2.供体基因不是置换受体基因，而是插入attB位点，因此使宿主体内带有两个拷贝的转导基因。例如用dgal+转导受体gal-后，宿主体内将既有gal+又有gal-基因，由于gal+对gal-为显性，因此宿主能够利用半乳糖。本章要点F-菌株、F+菌株、Hfr菌株F因子、F´因子转化、接合、性导与转导(普遍性转导、局限性转导、)温和噬菌体、烈性噬菌体、原噬菌体本章要点细菌中遗传物质的交换有三种主要的机制：转化、接合和转导。接合需要两个细菌细胞间的物理接触，F+细胞能将F因子转移给不具F因子的F-细胞，使之成为F+细胞。如果F因子整合到染色体上，它就成为HFr菌株，能将细菌染色体转移到F-细胞。F因子从HFr染色体上分离出来时带有一小段宿主染色体，这种含有细菌基因组的F因子就叫做F’因子。在接合过程中通过F’因子将某个特异的细菌基因传递给受体的过程称为性导。利用接合可制作远距离基因的遗传图。在转化中，单链DNA从周围环境中通过细胞膜进入受体细胞，并且通过重组整合到受体细胞的DNA上。转化对于将外源DNA整合到细菌细胞中特别有用，是现代基因工程中常用的技术。转导可用于紧密连锁基因的精确定位。因此，两个紧密连锁的遗传标记通过它们的共转导频率能进行精确的定位。转导分为普遍性转导和特异性转导两种。