谷胱甘肽标签蛋白纯化精品资料GST标签蛋白纯化
流程
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(1)装柱、平衡吸取适量GSTbeads加入层析柱中。加入15-20CV的ddw,清洗亲和柱。注入15-20CV的lysisbuffer,平衡亲和柱。(2)挂柱向平衡后的亲和柱中加入离心后的上清,使其缓慢流过GSTbeads,使标签蛋白充分与GSTbeads结合。收集流过的液体并取样。(3)洗涤用足量的lysisbuffer洗涤GSTbeads。收集流过的液体并取样。(4)洗脱Elutionbuffer洗至目的蛋白被洗出。收集流过的液体并取样。(5)SDS-PAGE检测各步骤取样。注:1)充分破菌后需要高速(16000-18000rpm)离心45-60min,上清最好使用0.45um针头式过滤器过滤后再加入平衡后的亲和柱。2)lysisbuffer一般使用20MmTris-Cl,500MmNaCl,5%glycerol,pH由具体蛋白确定。或直接使用已选定的lysisbuffer。3)洗涤时,加入10-15CVlysisbuffer,可以用bradford检测穿出液是否还有杂蛋白洗出以确定洗涤的体积。如果没有杂蛋白再洗出可以停止洗涤。4)洗脱时,Elutionbuffer一般使用lysisbuffer配制。一般如果配制50ml,需要称取0.3gGSH溶解到40ml左右的lysisbuffer中,调节pH至lysisbuffer的数值后定容至50ml。GSH终浓度约为0.02mol/L,酸性,记得一定要调节pH。仅供学习与交流,如有侵权请联系网站删除谢谢2