第32章RNA的生物合成与加工

第32章RNA的生物合成与加工DNA指导的RNA合成RNA的转录后加工RNA指导的RNA合成一、DNA指导的RNA合成☆RNA的生物合成包括转录和RNA的复制（一）DNA指导的RNA聚合酶1、DNA指导的RNA聚合酶催化RNA合成的特点：（1）不需引物.（2）原料：NTP（3）合成方向：5/→3/端（4）模板：模板是DNA,在体内只能以DNA一条链为模板转录，叫不对称转录，转录的链叫模板链(有意义链或负链),另一链叫编码链(反意义链或正链)（5）促进因子:Mg2+能促进聚合反应.（6）无3/→5/外切酶活性，也无5/→3/外切酶的活性，过去认为RNA聚合酶无校对功能，现在认为有校正功能，只是校正功能有限.2、大肠杆菌RNA聚合酶全酶的组成：由5个（有的书上是6个）亚基组成，分别是α、α、β、β/、σ和ω组成，σ叫起始亚基，功能是辨认起始位点，又叫起始亚基；2α和ββ/组成核心酶，核心酶没有启动功能，它的功能是在已开始合成的链上移动，边移动边解开双链，边按5/→3/方向延长核苷酸链，ω亚基相对分子质量较小，功能不清楚。酶的活性中心内有Zn2+.原核细胞中只有一种RNA聚合酶3、大肠杆菌RNA聚合酶结构与功能：酶的形状象一个多突起的椭球体（1）α亚基位于酶的一端，功能是：酶的组装和识别启动子并与之结合并使转录起始。（2）β和β/亚基，是最大的两个亚基，形状象螃蟹的前螯，功能是：与模板DNA结合，结合核苷酸底物，催化磷酸二酯键形成，是酶的催化中心。（3）σ-亚基，窄而长，分为4个区，2区与启动子的-10序列结合并解开双螺旋，4区与启动子的-35序列结合，1区和3区起调节作用。（4）大肠杆菌RNA聚合酶的活性中心有多个通道，β和β/亚基之间的裂缝为DNA入口的通道，进入活性中心的DNA遇到蛋白质壁产生转折，促使双链解开，模板链与非模板链分开分别进入两通道并在出口处重新形成双螺旋（二）转录单位、启动子和转录因子1、转录单位：起始于DNA模板的一个特定位点，在另一位点终止(终止子)，此转录区域称为一个转录单位。转录起点左边的序列叫起始点上游序列,在上游序列中有启动子，右边的序列叫下游序列，即转录区.以转录起点以合成第一个核苷酸为界(有的书以启动子为界),上游的DNA碱基记为负(-),下游的记为正(+).2、启动子：是能被RNA聚合酶的σ-亚基识别并结合以开始转录的一段DNA序列。利用足迹法和DNA测序法能确定启动子的核心脱氧核苷酸序列3、转录因子：RNA聚合酶起始转录需要的辅助因子，辅助因子的作用或是识别DNA的顺式作用元件，或是识别其它因子，或是识别RNA聚合酶。4、启动子的共有序列：共有序列可以不连续，从起点上游约-10序列处找到共有序列TATAAT，含6bp，叫Pribnow框（box框）或称为-10序列，实际位置在不同启动子中略有不同；在box框中各碱基出现的频率为T80A95T45A60A50T96，该序列含有A-T碱基较多，容易解开双螺旋。在起点上游约-35序列处也有一共有序列T82T84G78A65C54A45。-35序列提供了RNA聚合酶的识别信号，-10区域有助于解开双螺旋。启动子的序列多种多样，具有共有序列是常见的结构，但最弱的启动子没有-35序列（三）原核细胞的转录过程模板识别与转录起始链延长：链终止：不依赖于ρ因子的终止；依赖与ρ因子的终止二、RNA的转录后加工1、转录合成的RNA,叫原初转录产物，原初RNA经过一定程度的加工和修饰，才能变为成熟的mRNA.。mRNA作为蛋白质的合成模板,一个mRNA可以为一条多肽链编码,也可为多条多肽链编码，为一条多肽链编码的mRNA叫单顺反子,为二条或多条多肽链编码的为多顺反子。2、真核细胞的mRNA为单顺反子,因为真核细胞功能相关的基因不连在一起形成操纵子,不产生多顺反子.原核细胞的mRNA结构简单,由于功能相近的基因连在一起形成操纵子一块转录,产生多顺反子.3、原核生物的mRNA除少数外，一般不进行加工，转录和翻译可同时进行。但rRNA和tRNA需经过加工才能形成活性RNA；真核生物的mRNA、rRNA和tRNA都需要加工（一）真核生物mRNA前体的一般加工：1、真核细胞mRNA的原初转录产物是分子量极大的前体,在核内加工过程中形成大小不等的中间物,称为核内不均一RNA(hnRNA),有一小部分经进一步加工成为成熟的mRNA．2、把hnRNA加工为成熟mRNA的过程包括：（1）５/-端形成帽子(保护mRNA不被5/-核酸外切酶降解)（2）3/-端形成多聚腺苷酸的尾巴,尾巴不能阻止3/-核酸外切酶的降解作用,尾巴越长,3/-核酸外切酶作用的时间越长,mRNA的寿命越长.（3）剪去内含子转录的mRNA片段,把外显子转录的mRNA连接起来.（4）链内部核苷被甲基化（1）5/-加帽真核生物mRNA5/-端都有帽子，在hnRNA分子中就有帽子结构，在hnRNA分子的5/-端为三磷酸嘌呤核苷；转录起始后不久在RNA三磷酸酯酶的催化下从5/-端脱去一个磷酸，然后在mRNA鸟苷酰转移酶催化下，与GTP反应生成5/,5/-三磷酸相连的键，并释放出焦磷酸；最后在甲基转移酶催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基进行甲基化，产生帽子结构5/-帽子的功能：确切功能不十分清楚，推测它可能在翻译过程中被识别和对mRNA起稳定作用。（2）真核细胞mRNA3/-加尾真核细胞mRNA的3/-端通常都有20~200个腺苷酸残基构成的多聚腺苷酸的尾巴结构，核内的hnRNA3/-端也有多聚腺苷酸形成的尾巴，hnRNA的尾巴比mRNA的尾巴略长，平均为150~200个腺苷酸残基。病毒的mRNA3/-端也有多聚腺苷酸尾巴。真核细胞和病毒的mRNA的3/端存在加尾信号AAUAAA（3）剪去内含子，连接外显子真核生物的基因是断裂基因，但也有少数编码蛋白质的基因及tRNA和rRNA基因是连续的。断裂基因的外显子和内含子一起转录，转录产物经过剪接除去内含子部分，将外显子链接起来。内含子有多种多样的结构，剪接机制也多种多样。剪接机制共有4种方式：类型Ⅰ自我剪接类型Ⅱ也是自我剪接核mRNA剪接体剪接核tRNA的酶促剪接。在某些生物中，RNA也是遗传信息的载体，也能复制合成与自身相同的分子，某些病毒RNA，当它侵入到宿主细胞后，可借助复制酶（RNA指导的RNA聚合酶）进行病毒RNA的复制。如大肠杆菌的噬菌体有f2、MS2、R17和Qβ所含的核酸都是RNA，当他们侵入到宿主细胞后，利用RNA复制酶合成病毒RNA。三、RNA指导下RNA和DNA合成（一）RNA指导下RNA和DNA合成1、噬菌体QβRNA的复制2、病毒RNA复制的主要方式（二）逆转录作用（RNA指导的DNA合成）1970年Temin和Mizufani等人分别从致癌病毒中发现了以RNA为模板催化合成DNA的酶叫逆转录酶,也叫RNA指导得DNA聚合酶.当逆转录病毒感染宿主细胞时,单链RNA病毒和酶一起进入宿主细胞.1、逆转录酶（RNA指导的DNA聚合酶）（1）逆转录酶催化DNA合成所需条件：底物：dNTP模板：RNA方向：5′→3′逆转录酶中含有Zn2+引物：tRNA(不同生物引物是不同氨基酸的tRNA)，需要引物具有3′OH末端，在引物的3/-末端按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补与RNA的DNA，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在逆转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以杂交体的DNA为模板合成第二条DNA链。形成的双链DNA（cDNA）（2）逆转录酶也是多功能酶，主要包括以下几种活性:①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。反转录酶不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA错误率比较高,一般每加20000个脱氧核苷酸就会出现一个错误的核苷酸,所以单链RNA病毒突变率高。②核糖核酸酶H（RNaseH）的活性；由逆转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性：以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA链。除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。2、逆转录过程（1）逆转录病毒的RNA、引物和酶（逆转录酶和整合酶）进入宿主细胞，在宿主细胞的胞质中发生逆转录作用，先形成cDNA。（2）cDNA进入宿主细胞核，在整合酶帮助下整合到宿主细胞的染色体DNA上，叫前病毒，前病毒随宿主细胞染色体DNA复制而复制，只有整合的前病毒DNA转录的mRNA才能指导蛋白质的合成。逆转录过程复杂：3、逆转录的意义逆转录的发现对于基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 技术起了很大的推动作用，逆转录酶目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，可构建出cDNA文库(cDNAlibrary)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。逆转录病毒引起癌症和艾滋病绝大多数逆转录病毒侵入宿主细胞后,并不杀死宿主细胞,它们整合到宿主DNA分子上并随之一起复制,但有些病毒有一额外的基因,可使细胞癌变,这类病毒叫RNA肿瘤病毒.肿瘤病毒中导致肿瘤的基因叫致癌基因.人类获得性免疫缺陷病毒(HIV)也是逆转录病毒,HIV病毒不引起肿瘤,但它能杀死宿主细胞，主要是效应T细胞。HIV病毒中的某些基因,以极快的速度发生突变,使得疫苗制造起来特别困难.这种病毒的逆转录酶比其他病毒中的逆转录酶的错误倾向大10倍以上.这是这类病毒突变率高的主要原因.所以临床上治疗艾滋病的药物是逆转录酶抑制剂.