生物技术在植物病理学中的应用

生物技术在植物病理学中的应用生物技术的概念在植物病理学中应用的生物技术生物技术在植物病理学中的应用什么是生物技术？我们的祖先早就在几千年前就已经学会利用发酵、酿酒、制酱、育种等传统生物技术，但是当代概念的生物技术与之有着根本的区别。当代生物技术是应用现代生物科学及某些工程原理，利用生命有机体（从微生物到高级动物）及其组成（含器官组织、细胞、细胞器甚至基因）来发展新产品或新工艺的一种技术体系。从严格的意义上讲，生物技术是以生命科学为基础，利用生物的特性或功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理和技术相结合进行社会生产或为社会服务的综合性技术领域。从下个世纪人类面临的能源、食品和环境三大危机来看，生物技术具有巨大潜势。生物技术在植物病理学中的应用在植物病理学中应用的生物技术组织培养脱毒技术单克隆抗体技术转基因抗病植物组织培养脱毒技术基本程序无菌条件下取茎尖或根尖0.5mm分生组织，至培养基上培养成试管苗ELISA检测是否带毒将无毒苗切段快繁经练苗后移栽防虫网室内长成后收集微型薯组织培养脱毒技术马铃薯组织培养脱毒8个技术要点茎尖培养试管苗试管苗病毒检测试管苗的切段快繁培养瓶选择合适的封口塑料改善光质条件注意培养室温度控制和经常消毒选择生长健壮的脱毒苗作为扩繁材料使用B9培养壮苗马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之一茎尖培养试管苗取健康薯在室内催芽（38℃for14d），无菌条件下剥取带1-2个叶原基的生长点，接种到培养基上，培养温度21-25℃，200Lx。培养基配方：MS+6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.05mg/L+萘乙酸（NAA）0.1mg/L+赤霉素（GA3）0.1mg/L+3%蔗糖植物组织培养流程马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之二试管苗病毒检测聚丙烯凝胶电泳法-检测纺锤块茎类病毒酶联免疫吸附测定法-检测PVX、PVY等病毒指示植物接种法-辅助 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之三试管苗的切段快繁采用简化的MS培养基成分：大量元素、微量元素、铁盐、3%食用白糖、琼脂和自来水。该培养基的优点：6-8d即可生根，叶芽萌发率高，植株健壮。马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之四培养瓶选择合适的封口塑料-聚丙烯制成的耐高压盖子马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之四培养瓶选择合适的封口塑料-聚丙烯制成的耐高压盖子马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之五改善光质条件尽量利用散射光，即将培养室建成玻璃温室状马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之六注意培养室温度控制和经常消毒室温20-25℃为宜，26℃顶部易烧苗，33℃瓶苗停止生长。培养室经常用福尔马林和高锰酸钾熏蒸消毒，每7d一次。马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之七选择生长健壮的脱毒苗作为扩繁材料健壮的试管苗转接后，生长整齐健壮，繁殖效率高，可形成良性循环。马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之八使用B9培养壮苗脱毒苗移栽前的最后一次转接，可在MS简化培养基中加入生长延缓剂B910-15mg/L，加B9的脱毒苗生长健壮，节间短，叶色深绿，移栽成活率高。马铃薯组培苗的练苗移栽试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，保持较高的空气湿度。马铃薯组织培养脱毒苗移栽到温室马铃薯组织培养脱毒生产的微型薯返回单克隆抗体技术免疫反应原理当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。单克隆抗体技术单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞产生抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。单克隆抗体技术基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下：dcbad抗原决定簇动物免疫骨髓瘤细胞B淋巴细胞细胞融合abc杂种骨髓瘤细胞选a融合细胞克隆化培养抗原abaaaacd单克隆抗体技术制备单克隆抗体的主要步骤抗原制备动物免疫免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备细胞融合杂交瘤细胞的选择培养杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的克隆化单克隆抗体的检定分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立单克隆抗体的大量生产杂交瘤细胞系的冻存单克隆抗体技术-抗原制备细菌细胞抗原的制备单克隆抗体技术-抗原制备可溶性抗原制备①离心分离法②盐析法③分子筛效应④离子交换色谱单克隆抗体技术-抗原制备半抗原免疫原的制备多糖、多肽、甾体激素、脂肪酸、类脂质、核苷酸、药物（包括抗生素）以及其他化学物品载体有蛋白质类，多肽聚合物，大分子聚合物和某些颗粒。常用的蛋白有BSA,HSA,多肽有多聚赖氨酸（poly-L-lysine）青霉素半抗原的制备单克隆抗体技术-动物免疫颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。初次免疫1×10７／0.5ml(腹腔内注射)　　　　　　　↓　2-3周后　　　　　　第二次免疫1×10７／0.5ml(腹腔内注射)　　　　　　　↓　3周后　　　　　　加强免疫(融合前三天)1×10７／0.5mlip或iv(静脉内注射)　　　　　　　↓　　　　　　取脾细胞融合单克隆抗体技术-动物免疫可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。　　　　　　初次免疫　Ag　1-50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射　　　　　　　　│　　　　　(一般0.8-1ml　0.2ml／点)　　　　　　　　↓3周后　　　　　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip　　　　　　　　│　　　　　　　(ip剂量不宜超过0.5ml)　　　　　　　　↓3周后　　　　　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip　　　　　　　　│(5-7天后采血测其效价，检测免疫效果)　　　　　　　　↓2-3周后　　　　　　加强免疫，剂量50-500μg为宜，ip或iv　　　　　　　　↓3天后　　　　　　　取脾细胞融合　　①将可溶性抗原颗粒化或固相化，增强了抗原的免疫原性，同时降低抗原的使用量。②直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平。单克隆抗体技术-细胞融合将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，用不完全培养液洗1次，1200rpm离心8分钟。弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。在室温下融合:30秒内加入预热的1ml45％PEG4000,含5％DMSO，边加边搅拌。作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。离心，800rpm，6分钟。弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。单克隆抗体技术-选择杂交瘤HAT选择培养液：次黄嘌呤（H）核苷酸前体，使cell通过替代途径合成DNA；氨基蝶呤（A）叶酸拮抗物，阻断cell合成DNA的主要途径；胸腺嘧啶核苷（T）使cell通过替代途径合成DNA在HAT培养液中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。单克隆抗体技术-杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。单克隆抗体技术-抗体的检测一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。　　常用的方法有:ELISA（酶联免疫吸附测定）用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。RIA（放射免疫性鉴定）用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。IFA（免疫荧光分析）用于细胞和病毒McAb的检测。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。酶联免疫吸附测定-ELISAIndirect-ELISA操作过程包被抗原(Ag)每孔100微升，每样品两次重复，以碳酸缓冲液为空白对照，设正负对照。37℃下包被2小时，然后用PH7.4PBST缓冲液冲洗3~5次，注意避免各孔互混，每次冲洗至少5分钟。抗原稀释液为pH9.6碳酸缓冲液：1L蒸馏水中加Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，NaN30.2g。pH7.4PBST洗涤缓冲液：NaCl8g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O2.9g，KCl0.2g，NaN30.2g，distilledwater1L，Tween200.5ml，NaN30.2g。Indirect-ELISA操作过程加抗血清（As）100微升/孔，37℃1小时，用上述方法冲洗。抗血清稀释液：pH7.4PBS+2%PVP（砒咯烷酮）加酶标物100微升/孔，37℃1小时，用上述方法冲洗。酶标物稀释液：pH7.4PBST，一般稀释倍数为1：800或1：1000或1：1200，事先可用底物标定，选择合适的酶浓度。Indirect-ELISA操作过程加底物（邻苯二胺）100微升/孔，暗处反应20~30分钟。底物液配制（现用现配）：0.1M枸橼酸（无水枸橼酸19.2g/L）24.3ml，0.2M磷酸氢二钠(12个水磷酸氢二钠71.6g/L或无水磷酸氢二钠28.4g)25.7ml，distilledwater50.0ml混合，即为100mlPH5.0磷酸—枸橼酸（柠檬酸）缓冲液。临用前加入邻苯二胺40mg暗处搅动至溶解，最后加入0.15ml30%H2O2，混合后避光保存。注意配制底物的整个过程需在避光下进行。Indirect-ELISA操作过程加2MH2SO4终止反应取98%H2SO411ml加蒸馏水89ml即为100ml2MH2SO4。用酶联仪测490nm下的OD值。返回转基因抗病育种转基因抗病育种的基本步骤目的基因的获得选择高效的转导方法农杆菌介导法基因枪法花粉管导入法组织培养检测PCR法-检测目的基因是否存在ELISA法-检测目的基因的表达产物-蛋白质直接检验：接种病原物PCR-体外扩增DNA模板DNA引物dNTPMg2+TaqDNA聚合酶PCR仪PCR反应程序设计94℃预变性6min,94℃30s;使模板DNA充分解链52℃退火45s，使引物分别连接到3’端和5’端72℃延伸30s，在TaqDNA聚合酶作用下，DNA链延伸45个循环后，将获得大量目的DNA片断终延伸72℃7minPCRPCR产物的电泳检测影响PCR扩增结果的因素模板DNA浓度引物浓度dNTP浓度Mg2+浓度TaqDNA聚合酶浓度模板DNA浓度对扩增的影响M123456789M：DL2000marker；1-9：DNA用量10ng、20ng、30ng、50ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ngMg2+浓度对扩增的影响M1234567M：DL2000marker；1-7：Mg2+浓度0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mMdNTP浓度对扩增的影响M123456789M：DL2000marker；1-9：dNTP浓度0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mMTagDNA聚合酶浓度对扩增的影响M1234567M：DL2000marker；1-7：TagDNA聚合酶浓度0.5U、1U、1.5U、2U、3U、4U、5U