质粒DNA的提取与酶切鉴定（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定1、质粒简介质粒是一种寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA分子，大小为1kb~200kb之间，具有自主复制和转录的能力，但其复制和转录要利用宿主细胞（细菌）编码的一些酶和蛋白质。2、分离纯化质粒的原理分离纯化质粒DNA主要是利用宿主细菌DNA与质粒DNA之间的差异来进行的。（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定细菌DNA与质粒DNA形状上均为双链环形，但二者的分子量相差较大，细菌DNA的分子量在109D左右，而质粒DNA的分子量仅为106~107D，提取纯化质粒的过程中，细菌DNA大多断裂成线状分子，而质粒DNA则多数仍为双链环状，从而即可将二者分开。本试验采用微量碱变性法来分离纯化质粒DNA，具体的分离纯化原理如下：0细菌（含质粒）溶菌酶（震荡）破细胞壁SDSNaOH（细菌DNA和质粒DNA均通过碱变性成为线状分子）破细胞膜冰醋酸细菌DNA与变性蛋白和细胞碎片缠绕在一起（不能复性）质粒DNA经复性后变为共价闭合环状离心沉淀：细菌DNA、细胞碎片等上清：质粒DNA、RNA、可溶性蛋白等酚：氯仿离心下层：酚，氯仿中层：变性蛋白上清（水层）：质粒DNA、RNA等无水乙醇离心上清：可溶性杂质等沉淀：质粒DNA、RNA等RNase质粒DNA（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的天然结构为共价闭环（超螺旋）结构，但在制备过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA的分子可能呈现出如下几种构型：①超螺旋型（共价闭环）质粒DNA：（cccDNA）超螺旋状。②开环质粒DNA：（ocDNA）质粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，从而形成松弛的环状分子。③线状质粒DNA：（linearDNA）质粒DNA的两条链在同一处断裂，从而变为线状分子。（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定电泳时，由于分子形状的不同，三种质粒DNA的泳动行为不同，根据电泳迁移率从小到大的顺序分别为开环质粒DNA、线状质粒DNA和超螺旋质粒DNA。3、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定原理核酸是一种两性电解质（碱基、磷酸），在pH8.0下，核酸带负电荷，电泳时向正极移动，根据核酸分子所带电荷的多少，分子的大小及构型的差异，可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴定。（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定电泳中所使用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，核酸中常用琼脂糖凝胶。不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离200bp~50kb的DNA片断，通过在琼脂糖溶液中加入低浓度的莹光染料溴乙锭（EB），在紫外光下即可检测出10ng的DNA条带。当用琼脂糖凝胶电泳法检测质粒DNA样品时，根据条带的位置即可知道质粒DNA的三种构型及其比例，（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定此外，还可了解质粒样品中的杂质，如RNA、染色体DNA、蛋白质等的污染程度。电泳时如用已知分子量的核酸作对照，还可测定样品核酸的分子量。4、材料与试剂⑴、试验材料含有重组pUC312质粒(2992bp)的菌株。见图1⑵、试验试剂试验试剂及使用时的注意事项解说详见P144及P147。（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定5、操作步骤⑴、质粒的提取质粒提取的操作方法及注意事项解说详见P145。⑵、电泳鉴定胶浓度：1.0%各步操作方法及注意事项解说详见P148。6、实验结果及处理仔细观察纯化过程中各步试验现象。仔细观察电泳后荧光带的显示情况，据此绘制电泳图谱并对图谱进行简要说明。（二）、质粒DNA的酶切鉴定1、限制性内切酶简介限制性内切酶或限制性核酸内切酶（RestrictionEnzymeorRestrictionEndonuclease）是指能辨认双链DNA分子中的特异碱基序列，并在此序列处以内切方式将DNA双链同时切断的一类酶。根据它们的作用特点，可将其分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶，在同一种酶分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用，Ⅰ类酶由于切割位点随机，Ⅲ类酶则由于切割位点不对称，因此这两类酶的作用都不大。（二）、质粒DNA的酶切鉴定Ⅱ类酶由两种酶组成，一种为限制性核酸内切酶，另一种为独立的甲基化酶。其中，对我们最为有用的是Ⅱ类酶中的限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶广泛存在于原核生物中，1970年由H.O.Smith等从流感嗜血菌中最先分离得到。现已发现近几百种(498种)。该类酶能识别DNA分子中的特异序列，并在此序列处切断DNA双链。（二）、质粒DNA的酶切鉴定绝大多数限制性内切酶的识别序列为4个~6个碱基对，该序列具回文对称结构，且富含GC。（即旋转1800后与原来结构相同），少数酶可识别更长的序列或兼并序列。限制性内切酶切割后的DNA片断，有的产生粘性末端，有的产生平末端。如：⑴、产生粘末端的酶（二）、质粒DNA的酶切鉴定BamHⅠ：GGATCCHindⅢ：AAGCTTCCTAGGTTCGAA两条链的断裂位置是交错地担又对称地围绕着一个对称轴排列。⑵、产生平末端的酶：HaeⅢ：GGCCCCGG两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心。常用限制性内切酶的酶切位点可参见有关书藉。（二）、质粒DNA的酶切鉴定限制性内切酶由于能识别特异顺序并进行切割，因而在基因重组、序列分析、基因组甲基化分析及基因物理图谱的绘制等技术中被广泛应用。2、质粒pUC312的酶切图谱质粒pUC312的酶切图谱见图2。⑴、由图可见，实验所用的HindⅢ在质粒pUC312上为双切点的限制性内切酶，pUC312经HindⅢ酶切割后可产生大小二片段，大片段为2.68bp，小片段为312bp。（二）、质粒DNA的酶切鉴定如为完全酶切，电泳后应产生这两个片段的电泳图谱，由此即可对提取的质粒进行鉴定。⑵、而BamHⅠ在质粒pUC312上为单切点的限制性内切酶，pUC312经BamHⅠ酶切割后只产生一个大片段2.992bp，如为完全酶切，电泳后应产生线状的2.992bp片段，由此可进一步对提取的质粒进行鉴定。（二）、质粒DNA的酶切鉴定3、酶切反应标准体系的建立（二）、质粒DNA的酶切鉴定4、影响限制性酶切反应的因素DNA纯度、缓冲液、温度及限制酶本身都会影响酶的活性。为避免污染，每次吸取限制酶时都需用新的吸管头。应注意，如采用两种限制酶进行切割，则必须分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同种缓冲液，则可同时水解，否则低盐浓度的限制酶必须先用，待调节盐浓度后，再用高盐浓度的限制酶水解。（二）、质粒DNA的酶切鉴定也可在第一个酶切反应完成后，将第一个酶变性除去后再进行第二个酶切反应。3、操作方法1、HindⅢ酶DNA切酶反应的操作⑴向一无菌Eppendorf管中加入ddH2O8ul10×buffer2ul重组质粒DNA（pUC312）8ul（约1ug)HindⅢ酶2ul————————————————————————总体积20ul试验步骤及注意事项参P149。4、实验结果及处理仔细观察电泳后荧光带的显示情况，据此绘制电泳图谱并对图谱进行简要说明。注意与未经酶切的质粒的电泳图谱相比较。图1图2
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