第六章抗体的表达

第六章抗体的表达第一页，共27页。目前抗体的主要类型：1、多克隆抗体：通过免疫手段制备。2、单克隆抗体：通过杂交瘤技术制备。3、基因工程抗体：包括嵌合抗体、改型抗体等，通过基因工程手段制备，涉及 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 、构建与表达等。第一节概述*第二页，共27页。*第三页，共27页。要想获得全长的抗体分子，就必须选择恰当的抗体表达系统，而要使所表达的蛋白质结构不具有免疫原性或避免半衰期过短，就需要使用一个 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的抗体工程技术生产全人抗体。在抗体表达过程中，选择一种合适的表达系统，要考虑多种因素的影响，包括抗体的结构、糖基化作用以及表达抗体的产量、纯化的难易度和生产成本等。目前用于抗体表达的系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。*第四页，共27页。*第五页，共27页。表达系统的选择主要取决于表达抗体的用途和抗体的产量，而产量影响着抗体的经济效益。如果表达的抗体属于小分子片段，无需抗体效应作用和药物动力学活性，选用细菌表达系统就足够了。如scFv渗透性好，免疫原性弱，可以很快从血液中清除掉，常用与放射免疫 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 和肿瘤的原位治疗。如果表达的抗体用于治疗，需要延长抗体的药物动力学活性时间即抗体的半衰期，那么就需要选择全抗体，需要利用培养的动物细胞或转基因动物来表达。*第六页，共27页。原核表达系统操作简单、成本低、周期短，应用最为广泛，但不能对表达产物进行糖基化，且细菌类毒素污染很难去除。重组的蛋白常以包涵体形式分泌，要在体外折叠，费时费力，这使得大规模生产抗体受到限制。真核表达系统是最接近天然产生抗体的表达系统，比较成熟且应用较多。主要用于表达完整抗体分子，已可达到100mg/L的表达水平。但真核细胞培养有难度，需要附加设备，需要去除癌基因序列，防止病毒污染等。*第七页，共27页。蛋白表达系统大肠杆菌表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物表达系统酵母表达系统真核表达系统存在一些蛋白不能有效地折叠，发酵周期较长，容易污染，需要考虑表达产物的卫生安全性，筛选产物价格昂贵，有时表达产物没有生物活性等问题都为临床生产和应用带来了不便，也存在产物低表达或不表达的问题，产物纯化问题依然存在外源基因不能持久稳定地表达，而且表达成本很高，技术背景复杂存在不正确的糖基化修饰，且表达量低原核表达系统具有吸引力的原因在于它的成本低、生产率高和能够大规模快速的生产等优点*第八页，共27页。第二节原核表达系统原核表达是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，使其在特定原核生物或细胞内表达。人们为了获得高水平的基因表达产物，通过综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，设计出了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同性质、不同要求的目的基因的需要。*第九页，共27页。原核细胞表达系统基因表达的主要特点是：1、原核生物只有一种RNA酶，识别原核细胞启动子，催化所有RNA的合成，且其基因表达是以操纵子为单位。2、转录和翻译是耦联的，连续进行。3、缺乏真核细胞转录后的加工系统，不能去除内含子。4、原核细胞的基因控制主要在转录水平。5、在大肠杆菌mRNA核糖体结合位点上，有一个转录起始密码子和S-D序列。*第十页，共27页。原核表达系统主要有大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉素表达系统以及枯草杆菌和蓝细菌表达系统等。大肠杆菌遗传背景清楚，遗传图谱明确，生物化学与分子生物学充分了解，目的意淫表达产量高，生产成本低，周期短等，因此仍是表达异源性蛋白质的首选表达系统。受大肠杆菌自身加工能力的限制，不适合表达完整的抗体分子，多用来选择性表达Fab或scFV等抗体片段。*第十一页，共27页。一种表达体系的核心是表达载体及宿主菌，而表达方法的进步也主要体现在载体元件的优化和宿主菌基因型的改造上。理想的原核表达载体应具有以下特征：（1）稳定的遗传复制和传代能力；（2）具有显性的转化筛选标记；（3）启动子的转录是可调控的，抑制时本底转录水平较低；（4）启动子转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程中不影响表达载体的复制；（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。*第十二页，共27页。常用的原核表达载体分类及特征PET载体转录载体：用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起始密码子的目的基因翻译载体：包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达一些不带有核糖体结合位点的目的基因pET-21（+）、pET-24（+）和pET-23（+）pET载体系统为满足不同的需求，生产了带有His·Tag、T7·Tag、S·Tag、GST·Tag、ompT、CBDS·Tag、Thioredoxin、DsbA·Tag、Trx·Tag等标签的融合蛋白，其中带有S·Tag、His·Tag、T7·Tag的蛋白易于通过蛋白质杂交检测。*第十三页，共27页。pET28a载体图谱*第十四页，共27页。pCold系列表达载体Qing等人利用冷休克基因cspA启动子开发了一系列独特性的冷休克表达载体。cspA基因是当温度突然降低时，原核生物和真核生物都会表现出冷激反应，它们会通过合成冷激蛋白来克服冷激的不利影响。在低温下表达重组蛋白使大肠杆菌自身蛋白质合成受到抑制，促进目的蛋白正确折叠和提高蛋白可溶性。链长TEE序列HisTag标签FactorXa切断序列pColdⅠDNA4407bp有有有pColdⅡDNA4392bp有有无pColdⅢDNA4377bp有无无pColdⅣDNA4359bp无无无*第十五页，共27页。pColdⅠpColdⅡpColdⅢpColdⅣ载体图谱*第十六页，共27页。pGEX系列表达载体1987年，澳大利亚的smith和Johnson构建了表达融合蛋白的载体pGEX。pGEX系列表达载体就是采用GST作为载体的标签。它作为标签的好处在于它是一个高度可溶的蛋白，希望通过它提高蛋白的可溶性；另一个原因是它可以在大肠杆菌中大量表达。载体名称识别切割GST标签的酶pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3ThrombinpGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3FactorXapGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3PreScission*第十七页，共27页。pGEX-4T-1载体图谱*第十八页，共27页。抗体蛋白质在大肠杆菌中的表达方式：1、融合型表达优点：大大提高转运蛋白的溶解性，增加表达系统的稳定性，提高中间蛋白的折叠性，减少被降解的机会，从而增加融合蛋白在包涵体内的表达量。不足：让中间蛋白复性需要昂贵的蛋白酶；裂解不完全会导致产物减少；要获得有活性的蛋白，需要很多步骤才能完成；融合蛋白的可溶性难以保证。2、分泌型表达在载体中引入合适的引导肽序列，可以将抗体片段引导向胞周空间，允许抗体片段发生折叠、二硫键形成等。用这种方式生产的抗体片段具有与完整抗体类似的亲和常数，也有利于蛋白的富集和进一步纯化。*第十九页，共27页。抗体原核表达的一般操作过程：获得目的抗体基因：PCR或RT-PCR制备表达载体：选择表达载体要根据所表达蛋白的最终应用，如为方便纯化，可选融合表达，如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。将目的抗体基因插入表达载体中（测序验证：插入方向和可读框应都正确）转化表达宿主菌：抗性筛选或蓝白斑筛选诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析纯化和进一步检测*第二十页，共27页。第三节真核表达系统真核表达系统主要包括哺乳动物表达系统、昆虫表达系统以及酵母表达系统。真核生物基因组的特点：1、比原核基因组大得多；2、真核生物主要遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分，增加了基因表达调控的层次和复杂性；3、真核基因组为二倍体，原核基本为单倍体；4、真核生物mRNA为单顺反子，而许多活性蛋白是由相同或不同的多肽形成的亚基构成。5、哺乳动物基因组中仅约10%的序列为蛋白质；6、真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子和内含子，转录后需经剪接去除内含子；7、哺乳动物基因组中存在大量重复序列。*第二十一页，共27页。酵母表达系统的优点：1、具有强有力的乙醇氧化酶基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；2、可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，从而使表达的蛋白具有活性；3、营养要求低，生长快，培养基廉价，易于操作和培养，亦有利于工业放大生产；4、表达量高，许多蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达量可达到g/L以上水平；5、表达的蛋白既可存在于胞内，也可分泌到胞外。6、糖基化程度低；7、外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上，这样得到的基因工程菌株比较稳定。*第二十二页，共27页。一般操作步骤：目的基因克隆重组载体线性化转化筛选外源蛋白的表达鉴定放大*第二十三页，共27页。哺乳动物细胞表达系统优缺点：表达的外源蛋白最接近其天然构象，在蛋白合成起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，但在大规模培养时细胞会面临着对无血清培养基的适应性差、细胞无限度增殖以及细胞凋亡等难题。外源基因导入的方法：脂质体、磷酸钙、电穿孔及显微注射法等理化方法及病毒感染等。抗体在哺乳动物细胞表达系统中表达的一般操作过程：克隆目的抗体基因（经测序验证）-准备真核表达载体-将目的抗体基因插入表达载体中-转染-筛选-验证（PCR鉴定外源基因、免疫印迹鉴定蛋白表达、测定scFV基因对受体细胞增殖的影响）*第二十四页，共27页。昆虫细胞表达系统：能利用信号肽将外源基因分泌到胞外，而且能有效地进行蛋白质翻译后的加工与修饰。最常用的是杆状病毒介导的表达系统，杆状病毒属环状双链DNA病毒，具有严格宿主专一性，通常感染无脊椎动物。该系统最大的优点是蛋白表达水平高（1-500mg/L昆虫细胞培养液），但对培养基的营养要求高，要求掌握熟练的细胞培养技术。*第二十五页，共27页。第四节动植物表达系统动植物表达系统（动植物反应器）比传统的微生物和动物细胞表达系统产量高，成本低，而且蛋白产物可进行正确修饰，生物活性完整，适于表达结构复杂的大分子药用蛋白，如糖蛋白、磷蛋白、多亚基蛋白等。转基因动物：多以乳腺、唾液腺和膀胱为靶位。制作转基因动物的步骤：获得和改建目的基因，将目的基因向生殖细胞高效转移，受精卵或胚胎组织在合适环境中的发育、筛选及鉴定稳定的细胞系。*第二十六页，共27页。利用植物表达外源蛋白的优点：植物繁殖能力强，可以利用愈伤组织或原生质体连续培养；可以把外源DNA整合到基因组中获得转基因植株；一旦获得某重组抗体的转化株，要提高其产量只是农艺性状改良问题；能有效地组装轻链和全长重链，形成完整的抗体分子。*第二十七页，共27页。