实验五分子荧光光度法测定奎宁的含量一、一、实验目的1.荧光光度法的基本原理。2.了解掌握荧光光度计的结构及使用方法。3.荧光光度计的定量
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方法二、二、方法原理当分子在紫外或可见光的照射下，吸收了辐射能后，形成激发态分子，分子外层的电子在10-8S内返回基态，在返回基态的过程中，部分能量通过碰撞以热能形式释放，跃至第一激发态的最低振动能级，其余的能量以辐射形式释放出来。这种分子在光的照射下，分子外层电子从第一激发态的最低振动能级跃至基态时，发射出来的光称为分子荧光。它是由于光致发光而产生的，通常分子荧光具有比照射光较长的波长。分子荧光强度可用下式
表
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示：IF=2.3K，KbcI0(5-1)当I0一定时If=KC(5-2)式中K’取决于荧光效率，K是荧光分子的摩尔吸光系数，b是液槽厚度，c是荧光物质的浓度。由此可见在一定条件下，荧光强度与物质的浓度呈线性关系。又因荧光物质的猝灭效应，此法仅适用于痕量物质分析。奎宁在稀酸溶液中强荧光物质，它有两个激发波长250nm和350nm。荧光发射在450nm。在低浓度时，荧光强度与荧光物质量浓度呈正比I户kc三、三、仪器和试剂1、分子荧光光度计(4500型，江苏泰县电分析仪器厂)。它具有光度计、荧光计的功能，在可见光谱区G50nm〜700nm)进行工作。仪器用一根双叉型光张传输光线，因此可以避免环境中光的干扰，在进行荧光测量时能充分运用激发光能量，且“内滤效应”影响小。仪器有较强的适应能力和扩散性，如配以适当的传感器可以用于遥测和自动监测等。(1)波长范围：350nm〜700nm(2)波长精度：±2nm(3)度测量范围：T：0〜100.0%，A：0〜1.555(4)荧光检测极限：在0.1mol/LNaOH溶液中荧光素钠的检测限为5X10-9ng/Ml(5)光源：卤钨灯12V,50W(6)电源电压：220V+10%(7)光纤探头：2支1000mL容量瓶2只，5mL容量瓶10只，10mL吸量管1只。.试剂100.0Rg-mL-1奎宁贮备液:准确称取120.7mg硫酸奎宁二水合物，加50mL1mol-L-1H2S04溶解，用去离子水定容至1000mL。将此溶液稀释10倍即得10.0pg-mL-1奎宁标准溶液。0.05mol-L-1H2S04溶液。三、实验步骤系列标准溶液的配制取6只5mL容量瓶，分别加入10.0Rg・mL-1奎宁标准溶液0，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00mL，用0.05mol-L-1H2S04溶液稀释至刻度，摇匀。绘制激发光谱和荧光发射光谱在200〜400nm范围扫描激发光谱;在4OO〜600nm范围扫描荧光发射光谱。绘制标准曲线将激发波长固定在350nm(或250nm)，荧光发射波长固定在450nm，测量系列标准溶液的荧光强度。未知试样的测定取4〜5片奎宁药片，在研钵中研细，准确称取约O.1g，用0.05mol•L-1H2S04溶解，全部转移至1000mL容量瓶中，以0.05mol•L-1H2S04稀释至刻度，摇匀。取溶液5.00mL于50mL容量瓶中，用O.05mol-L-1H2S04溶液稀释至刻度，摇匀。在标准系列溶液同样条件下，测量试样溶液的荧光发射强度。绘制荧光强度If对奎宁溶液浓度c的标准曲线，并由标准曲线求算未知试样的浓度，计算药片中的奎宁含量。奎宁=Conc(pg/mL)X1000mLX50/0.1g四、注意事项奎宁溶液必须当天配制，避光保存。五、思考题
浙公网安备 33021202002483