细胞培养基础篇

细胞培养基础篇基础篇-无菌操作基本技术实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30—60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethano1擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2、无菌 操作工 操作工简历操作工简历操作工简历操作工简历操作工简历 作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3、小心取用无菌之实验物品，避免造成污染、勿碰触吸管尖头部或就是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4、工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或就是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生,小心毒性药品，例如DMSO及TPA等,并避免尖锐针头之伤害等、5、定期检测下列项目：5。1.CO2钢瓶之CO2压力。5.2、CO2培养箱之C6、水槽可添加消毒剂1、02浓度、温度、及水盘就是否有污染(水盘得水用无菌水，每周更换)。(ZePhrin1:750),定期更换水槽得水。基础篇一血清1.血清必须贮存于-25m10〜-70C，若存放于4C，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40~4分装于无菌50m1离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间否则易发生污染或容器冻裂之情形。2、一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基I内一起过滤，勿直接过滤血清。3。瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法):-20C至4C冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装厂般以50ml无菌离心管可分装40〜45m1、在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一，减少沉淀得发生。勿直接由-淀。20C直接至37C解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈4、heat—inactivation就是指56C，30分钟加热已完全解冻之血清、加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目得就是使血清中之补体成份(comp1ement)去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有:cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastce1lsandplatelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationofIymphocyticandmacrophagecelltype。5.勿将血清置于37C太久，若在37C放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。6.血清之沉淀物6、1.凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因就是血清中之脂蛋白(1ipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成,这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。基础篇-细胞传代培养1。细胞生长至高密度时，即须分殖至新得培养瓶中，一般稀释比例为1:3至1:6,依细胞种类而异。2、材料:无菌磷酸生理缓冲液(Du1becco'phosphate—bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D—PBS,GibcoBRL21600—010)2、2、trypsin—EDTAsolution(0、05%trypsin-0.53mMEDTA—4Na,GibcoBRL10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于-20C,使用前放在37C水槽回温。3。新鲜培养基4、无菌吸管/离心管/培养瓶步骤：1、附着型细胞(adherentcel1)1.1.吸掉旧培养液、用D—PBS洗涤细胞一至二次。25300-062):以3.3、3.3.1。2、2。，吸掉trypsin—EDTA溶液。(若不移去trypsin—EDTA,则在trypsintrypsin作用,离心后再吸掉上清液])。，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞,以正常培养条件培养。3。1.3、加入trypsin—EDTA溶液(1m1/25cm2,2ml/75cm2),37C作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时—EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止3。1.4、轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落团块，混与均匀后，依稀释比例转移至新得培养瓶中3。2。悬浮型细胞(Suspensioncell)3。2。1。吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。3.2。2.吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混与均匀后，依稀释比例转移至新得培养瓶中，以正常培养条件培养。3、3。融合瘤(hybridoma)3.3.1。有些hybridomacell需培养三天以上才会产生抗体，若就是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。基础篇一细胞冷冻保存1。注意事项：1。1。欲冷冻保存之细胞应在生长良好(10gphase)且存活率高之状态釣为80-90%致密度。idoma应在冷冻保存前一至二日测试就是1。2、冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质，例如hybr，无菌且无色(以0.22micronFGLPTelflml小体积分装,4C避光保存，勿作多次解在开启后一年内使用，因长期储存后对细否有抗体之产生。1。3、注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级on过滤或就是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650),以5~10冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存、胞会有毒性。1、4。冷冻保存之细胞浓度：e1Is/ml1.4.1。normalhumanfibroblast:1〜3*106c1。4.2。hybridoma:1~3x106ce1ls/ml,细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。1。4.3。adherenttumorlines:5~7x106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1—3x106cel1s/mI。1.4。4。othersuspensions:5~10x106cells/ml,humanlymphocyte须至少5x106cel1s/ml。1.5。冷冻保护剂浓度为5或10%DMS0,若就是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture,以防止冷冻失败、1、6.冷冻 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ：1。6.1。传统方法：4C10分钟--—>氮槽vaporPhase长期储存。1.6.2、程序降温：利用等速降温机以-0rPhase长期储存。适用于悬浮型细胞与材料：生长良好之培养细胞新鲜培养基DMSO（SigmaD—26502、2。2。1、2、3。—20C30分钟〉-80C16-18小时（或隔夜）-—-〉液1〜-3C/分钟之速度由室温降至-120C，放在液氮槽vaphybfidoma之保存。无菌塑料冷冻保存管（Nalgene5000—0020）2。5.0、4%w/vtrypanblue（GibcoBRL15250—061）2。6。血球计数盘与盖玻片2。7.等速降温机（KRYO10Seri3。步骤：3。1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基3。2。配制冷冻保存溶液（使用前配制置于室温下待用。3.3.依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（（约0。1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。2.4、esII)，观察细胞生长情形。）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5—10%，混合均匀，离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5x106cel分装于已标示完全之冷冻保存管中,1m1/Vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。冷冻保存方法1:冷冻管置于4C10分钟7-20C30分钟7—80CvaPorphase长期储存、冷冻保存方法2:冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。CELL3、4。3。5。夜）7液氮槽3。6。am7:HBls/ml，混合均匀,16〜18小时（或隔程序为：Progr基础篇一冷冻细胞活化1.冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现才会恢复正常（例如产生单株抗体或就是其它蛋白质）。材料：37C恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/离心管/培养瓶，液氮或干冰容器步骤：4.1操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害、4、2自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子就是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。4、3将新鲜培养基置于37C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。4.4取出冷冻管，立即放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%ethanol擦拭保存管外部，移入无菌操作台内、4。5取出0.9ml解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内I（稀释比例1：10〜1：15）,混合均匀，放入CO2培养箱培养。另取0、1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。4.6解冻后就是否立即去除冷冻保护剂（例如DMS0或glycerol）,依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1,000rpm,5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀,放入C02培养箱培养。4、7若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。附-细胞计数与存活测试1。原理：1、1。计算细胞数目可用血球计数盘或就是Coultercounter粒子计数器自动计数。1。2.血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1、0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104,即为每ml中之细胞数目。