血小板膜表面抗体测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)原理:直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体,加到经离心富集的血小板中,与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合,经过洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1.样本量至少1ml。.样本应在采集后6小时内完成,冷冻的标本或已固定的标本不能用。.样本血小板计数应在150-450×109/L之间。若>450×109/L,样本需要稀释,用PBS稀释;若<150×109/L,应多采集进行富集达到流式
检测
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的细胞数。.溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存联科成分1:单克隆抗体液体1ML2—8℃2:全血溶血试剂液体A:甲酸液体70ML室温B:碳酸钠等液体32ML室温C:多聚甲醛液体14ML室温3:鞘液液体20L室温4:清洗液液体5L室温5:荧光微球液体10ML2-8℃质控品BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra操作:富集血小板法:1)800r/min*15min,取上清,2)加4-5ml鞘液,2000r/min*3min,弃上清,重复一次。分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS(血小板的量约为106)(血小板若在正常范围,稀释到原量直接取10u1。)。混匀,避光,室温孵育20-30分钟洗或不洗,上机测样全血法:1)加4-5ml鞘液,1500r/min*15min,弃上清,后同上3)-6)报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV<2%灵敏度500—1000个荧光素分子参考值IgA<2.98%IgG<3.04%IgM<3.0%IgD<2.91%临床意义为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标,在ITP、胶原性疾病时升高。方案(Protocol)